کاربرد اسپکتروفتومتری در تعیین مشخصات رنگدانه های موجود در گیاهان

اسپکتروفتومتری و نقش امواج الکترومغناطیسی در فوتوسنتز گیاهان

گیاهان و برخی از باکتری­ ها و جلبک­ ها، برای تبدیل دی­ اکسید کربن و آب به گلوکز با استفاده از انرژی خورشید، غذای خود را تأمین می­ کنند.

در این فرآیند فوتوسنتز، گیاهان انرژی خورشید (یا تابش امواج الکترومغناطیسی) را به انرژی شیمیایی تبدیل می­ کنند که در پیوند های مولکول های گلوکز موجود در آنها ذخیره می­ شود و انرژی حاصل، فرآیند های متابولیک سلول­ ها را تأمین می­ کند و برای زندگی بر روی زمین ضروری است.

گلوکز یک کربوهیدرات ساده است که سوخت فوری سلول­ ها را فراهم می­ کند و همچنین بلوک ساختمانی پایه برای کربوهیدرات­ های پیچیده ­تر نیز هست.

در عمل فوتوسنتز، برای تبدیل انرژی نور از خورشید به انرژی شیمیایی (انرژی پیوند)، مولکول­ های رنگدانه امواج  الکترومغناطیسی (معمولاً در محدوده طیف مرئی) را جذب می ­کنند تا واکنش ­های شیمیایی را تقویت کنند.

در حقیقت رنگدانه ­های گیاهی، درشت مولکول­ هایی هستند که توسط گیاه تولید می­ شوند و طول موج­ های مشخصی از نور مرئی را جذب می­ کنند تا انرژی مورد نیاز برای فوتوسنتز را تأمین کنند.

اگر چه رنگدانه­ ها نور را جذب می­ کنند، اما برخی طول موج­ های نوری نیز توسط آنها جذب نمی ­شوند که به چشم منعکس شده و رنگ گیاهان را تعیین می­ کند و در حقیقت، این طول موج­ های منعکس شده رنگ­ گیاهانی است که مشاهده می­ کنیم.

شکل1- بازتاب نور و رنگ گیاهان

انواع رنگدانه های موجود در گیاهان

کلروفیل، از مهم‌ترین گروه رنگدانه‌ های دخیل در فتوسنتز، فرآیندی است که طی آن انرژی نور از طریق سنتز ترکیبات آلی به انرژی شیمیایی تبدیل می‌شود و کلروفیل برای فوتوسنتز ضروری است، اما رنگدانه­ های دیگری نیز وجود دارند که در جمع آوری و انتقال انرژی به آنها کمک می­ کنند.

علاوه بر نقش رنگدانه ها در عمل فوتوسنتز، به عنوان رنگ های طبیعی نیز در بسیاری از حوزه ها، به ویژه صنایع غذایی و دارویی نیز مورد استفاده قرار می گیرند و نیاز به کنترل کیفیت دارند.

رنگدانه های طبیعی

رخی از انواع مشاهده شده رنگدانه های طبیعی عبارت­ اند از:

• کلروفیل (سبز)
• کاروتنوئید (زرد، نارنجی قرمز)
• آنتوسیانین (قرمز تا آبی، بسته به pH)
• بتالاین (قرمز یا زرد)

نسبت این رنگدانه­ ها در برگ، در فصل پاییز تغییر می­ کند و در نتیجه درجات مختلفی از تخریب کلروفیل و کاروتنوئید ها و سنتز آنتوسیانین خواهیم داشت که زیبایی­ های فوق­ العاده­ ای را در پاییز رقم می­ زنند.

شکل2- تغییر رنگ برگ ها به دلیل تغییر نسبت میزان رنگدانه های موجود در آنها

شکل3- تغییر رنگ توت فرنگی در حین رشد، به دلیل تغییر میزان رنگدانه ها

کلروفیل

کلروفیل عمدتاً میزان فوتوسنتز و بهره ­وری اولیه در گیاه را تعیین می­ کند و به طور گسترده به عنوان پاسخی به استرس محیطی و کاربرد کود نیتروژن استفاده می­ شود.

محتوای کلروفیل با تغییر محیط خارجی تغییر خواهد کرد که می تواند منجر به تغییر ظرفیت فوتوسنتزی گیاه شود و بنابراین، محتوای کلروفیل می ­تواند به عنوان یک شاخص تشخیصی مهم برای مطالعه رشد گیاه مورد استفاده قرار گیرد.

رنگ برگ و محتوای کلروفیل نقش مهمی در رشد گیاه ایفا می­ کند و به ظاهر گیاهان کمک زیادی می­ کند.

تنوع رنگ و کلروفیل تا حدی توسط ژن­ ها کنترل می­ شود و برای اطمینان از کیفیت و رنگ ثابت برگ، کاهش این تنوع ضروری است که با برنامه­ های اصلاح ژنتیکی می ­توان به آن دست یافت.

با این حال، اصلاحات ژنتیکی معمولاً به حجم بزرگی از نمونه برای آزمایش متکی است و امروزه بیشتر از روش های اسپکتروفتومتری و کالریمتری برای کنترل استفاده می شود.

شکل4- تعیین پارامترهای کلروفیل ها با استفاده از اسپکتروفتومتری جذبی

کاروتنوئید

کاروتنوئید ها دسته ای از مواد شیمیایی گیاهی هستند و در سلول های طیف گسترده ای از گیاهان، جلبک ها و باکتری ها یافت می شوند و آنها به گیاهان کمک می کنند تا انرژی نور را برای استفاده در فتوسنتز جذب کنند.

کاروتنوئید ها رنگدانه های ضروری در اندام های فتوسنتزی همراه با کلروفیل ها هستند که رنگ های زرد، نارنجی، قرمز و بنفش را به نمایش می گذارند و همچنین، به عنوان محافظ نور، آنتی اکسیدان، جذب کننده رنگ و پیش ساز هورمون های گیاهی در اندام های غیر فتوسنتزی گیاهان عمل می کنند.

حیوانات قادر به سنتز کاروتنوئید ها نیستند، بنابراین آنهایی که در حیوانات یافت می شوند یا مستقیماً از غذا جذب شده اند و یا از طریق واکنش های متابولیکی اصلاح شده اند.

دو طبقه بندی کلی از کاروتنوئید ها وجود دارد: کاروتن ها و زانتوفیل ها و زانتوفیل ها حاوی اکسیژن هستند، در حالی که کاروتن ها هیدروکربن هستند و حاوی اکسیژن نیستند و همچنین، این دو رنگدانه، طول موج های مختلف نور را در طول فرآیند فتوسنتز گیاه جذب می کنند، بنابراین زانتوفیل ها زردتر هستند در حالی که کاروتن ها نارنجی هستند.

شکل5- تعیین مشخصات کارتنوئیدها با استفاده از اسپکتروفتومتری رامان

آنتوسیانین

آنتوسیانین ها ترکیبات پلی فنول هستند که رنگ های مختلفی از جمله صورتی، قرمز، بنفش و آبی را در گل ها، سبزیجات و میوه ها ایجاد می کنند و همچنین نقش مهمی در تکثیر گیاهان، اکوفیزیولوژی و مکانیسم های دفاعی گیاه دارند.

از نظر ساختاری، این رنگدانه ها آنتوسیانیدین هایی هستند که توسط قندها و اسیدهای آسیل اصلاح شده اند و رنگ های آنتوسیانین به pH، نور، دما و یون های فلزی حساس هستند و پایداری آنتوسیانین ها توسط عوامل مختلفی از جمله کمپلکس های بین مولکولی و درون مولکولی کنترل می شود.

روش های کروماتوگرافی و طیف سنجی به طور گسترده برای استخراج، جداسازی و شناسایی آنتوسیانین ها استفاده شده است و آنتوسیانین ها نقش عمده ای در صنایع دارویی، مواد غذایی و رنگ آمیزی، طعم دهنده و نگهداری مواد غذایی دارند.

شکل6- تعیین مشخصات آنتوسیانین ها با استفاده از اسپکتروفتومتری جذبی UV-Vis

بتالاین

بتالاین ها خانواده ای از رنگدانه های طبیعی گیاهی محلول در آب و شبیه به آنتوسیانین ها هستند که در اکثر گیاهان راسته کاریوفیلال ها وجود دارند و آنها رنگ هایی از زرد تا بنفش و همچنین ساختارهایی را ارائه می دهند که در گیاهان دیگر توسط آنتوسیانین ها رنگ می شوند و نه تنها میوه ها و ریشه های خوراکی بلکه گل ها، ساقه ها و براکت ها را نیز شامل می شوند.

گزارش شده است که طول موج حداکثر جذب بتالین در فاصله طول موج مرئی 536 تا 540 نانومتر است و علاوه بر آن، باند جذب دیگری در محدوده طول موجی بین 490 و 460 نانومتر نیز در طیف‌ها مشاهده شده است که مربوط به هیدروژن زدایی مولکول بتانین است.

شکل7- تعیین مشخصات بتالاین ها با استفاده از اسپکتروفتومتری جذبی UV-Vis

نقش طیف سنجی در تعیین رنگدانه ها

یکی از روش های مطمئن و سریع ارزیابی محتویات کلروفیل و سایر رنگدانه ها، بر اساس استخراج آنها با حلال­ ها، از برگ مخرب و به دنبال آن تعیین مشخصات با استفاده از دستگاه های اسپکتروفوتومتری است.

روش مرسوم برای به دست آوردن میزان رنگدانه­ ها در برگ با تعیین مقدار سه متغیر L (روشنی)، a (قرمزی) و b (زردی) از سیستم رنگ آزمایشگاهی CIELAB است و این روش ­ها زمان­ بر و پر هزینه ­هستند و نیاز به نیروی کار بیشتری در آزمایشگاه دارند و برای انتخاب ژنتیکی مناسب نیستند.

از طرفی این رنگدانه‌ های گیاهی طبیعی، از جمله آنتوسیانین‌ ها، بتالین‌ ها و کاروتنوئید ها، همگی ارزش سلامتی دارند که عمدتاً به دلیل توانایی‌ های آنتی‌اکسیدانی آنهاست و با این حال، ناپایداری رنگدانه های طبیعی گیاهی، از جمله تخریب و تغییر رنگ، تا حد زیادی مانع از کاربرد آنها می شود و استفاده از آنها را بسیار محدود می کند و نیاز به کنترل سریع فرایندی دارند.

طیف سنجی با تعیین سریع و غیر مخرب این ترکیبات در برگ‌ های زنده در محل، می‌تواند روشی مؤثر برای کاهش نیاز به تعداد زیادی نمونه در مزرعه، صرفه جویی در زمان و هزینه صرف شده در آنالیز باشد.

امروزه طیف سنجی، همراه با روش‌ های مدل‌ سازی شیمی‌ تجزیه، بعنوان روشی سریع و مؤثر برای تخمین اجزای شیمیایی و رنگدانه‌ای در برگ ها استفاده می­ شود.

طیف‌ سنجی مادون قرمز نزدیک (NIR) یک طیف سنجی انعکاسی رایج است که اغلب در تخمین شیمیایی گیاه استفاده می‌شود و عمدتاً بر مبنای تحریک ارتعاشی پیوند های مولکولی اصلی اجزای بیوشیمیایی، از جمله پیوند های C-H، N-H و O-H متکی است، که منجر به جذب متغیر در محدوده­ های مختلف طول موجی امواج الکترومغناطیسی می ­شود.

در این روش، نمونه‌ های مستقل برای اعتبارسنجی مدل استفاده می‌شوند و سپس مدل می‌تواند برای پیش‌بینی نمونه‌ های مجهول با طیف بازتاب آنها استفاده شود و NIR با کالیبراسیون قوی و توانایی غربالگری نمونه­ های بزرگ، توانایی قابل اعتماد و امیدوارکننده ­ای را در برنامه­ های اصلاح نژاد نشان داده است.

شکل8-تعیین مشخصات برگ­ ها در شرایط محیطی مختلف با استفاده از طیف ­سنجی نوری انعکاسی FTIR

اسپکتروفتومتر های جذبی نیز نور جذب شده توسط عصاره­ ی حاوی رنگدانه را اندازه ­گیری می­ کنند و در خروجی، اطلاعاتی را ارائه می­ دهند که در یک نمودار با عنوان طیف جذب رنگدانه ترسیم می­ شود.

شکل9- شماتیک کلی استفاده از اسپکتروفتومتر های جذبی در تعیین مشخصات رنگدانه ها

منابع و مراجع

• Li, Y., Sun, Y., Jiang, J. et al.Spectroscopic determination of leaf chlorophyll content and color for genetic selection on Sassafras tzumu. Plant Methods 15, 73 (2019). https://doi.org/10.1186/s13007-019-0458-0
• Zeng, J., Ping, W., Sanaeifar, A. et al.Quantitative visualization of photosynthetic pigments in tea leaves based on Raman spectroscopy and calibration model transfer. Plant Methods 17, 4 (2021). https://doi.org/10.1186/s13007-020-00704-3
• Borello and V. Domenici, Determination of Pigments in Virgin and Extra-Virgin Olive Oils: A Comparison between Two Near UV-Vis Spectroscopic Techniques, Foods 2019, 8, 18; doi:10.3390/foods8010018
• Gandía-Herrero F, Escribano J, García-Carmona F. Biological Activities of Plant Pigments Betalains. Crit Rev Food Sci Nutr. 2016;56(6):937-45. doi: 10.1080/10408398.2012.740103.
•  Wu, Q.; Fu, X.; Chen, Z.; Wang, H.; Wang, J.; Zhu, Z.; Zhu, G. Composition, Color Stability and Antioxidant Properties of Betalain-Based Extracts from Bracts of Bougainvillea. Molecules 2022, 27, 5120. https://doi.org/10.3390/Molecules27165120
• Alappat B, Alappat J. Anthocyanin Pigments: Beyond Aesthetics. Molecules. 2020 Nov 24;25(23):5500. doi: 10.3390/molecules25235500.
• wikipedia