اندازه‌گیری نیتریت در سوسیس و کالباس: روش گریس، مراحل آزمون و نکات کنترل کیفیت

رنگ صورتی کالباس و طعم آشنای سوسیس، تا حد زیادی به یک افزودنی کوچک بستگی دارد: نیتریت سدیم. همین ماده از رشد باکتری کشندهٔ کلستریدیوم بوتولینوم هم جلوگیری می‌کند. اما مقدارش باید دقیق کنترل شود؛ کمبود آن ایمنی محصول را پایین می‌آورد و مقدار اضافی‌اش برای سلامت مصرف‌کننده خطرناک است. به همین دلیل اندازه‌گیری نیتریت در فراورده‌های گوشتی یکی از آزمون‌های ثابت آزمایشگاه‌های کنترل کیفیت کارخانه‌ها و آزمایشگاه‌های همکار است.

در این مقاله روش استاندارد اندازه‌گیری نیتریت در سوسیس و کالباس را قدم‌به‌قدم توضیح می‌دهیم، اصول شیمیایی آن را مرور می‌کنیم و نکات کنترلی‌ای را می‌گوییم که نتیجهٔ آزمون را قابل اعتماد و قابل دفاع می‌کند.

چرا به سوسیس و کالباس نیتریت اضافه می‌کنند؟

نقش نیتریت در رنگ، طعم و ایمنی محصول

نیتریت معمولاً به شکل نیتریت سدیم (E250) و همراه نمک، به‌عنوان «نمک عمل‌آوری» به خمیر گوشت اضافه می‌شود. سه کار اصلی انجام می‌دهد:

• رنگ: نیتریت به اکسید نیتریک تبدیل می‌شود و با میوگلوبین گوشت ترکیب صورتی پایداری می‌سازد که بعد از پخت هم باقی می‌ماند.

• طعم: طعم خاص گوشت‌های عمل‌آوری‌شده تا حد زیادی به واکنش‌های نیتریت مربوط است.

• ایمنی: مهم‌ترین نقش آن مهار رشد کلستریدیوم بوتولینوم و تأخیر در فساد اکسیداتیو چربی‌هاست.

خطر نیتریت اضافی و تشکیل نیتروزآمین‌ها

نیتریت در مقادیر بالا سمی است و می‌تواند با تبدیل هموگلوبین به متهموگلوبین، انتقال اکسیژن در خون را مختل کند؛ کودکان به این اثر حساس‌ترند. نگرانی مهم‌تر، تشکیل نیتروزآمین‌ها است: ترکیباتی که از واکنش نیتریت با آمین‌های گوشت، به‌خصوص در دمای بالای سرخ‌کردن، ساخته می‌شوند و بسیاری از آن‌ها سرطان‌زا هستند. به همین دلیل تولیدکنندگان سعی می‌کنند کمترین مقدار نیتریتی را مصرف کنند که ایمنی میکروبی را تأمین کند، و معمولاً از آسکوربات یا اریتوربات هم برای کاهش تشکیل نیتروزآمین استفاده می‌کنند.

حد مجاز نیتریت در فراورده‌های گوشتی

حد مجاز نیتریت در قوانین هر کشور تعیین می‌شود و به نوع محصول بستگی دارد. دو نکته در خواندن این اعداد اهمیت دارد:

• بعضی مقررات مقدار افزوده‌شده در فرمولاسیون را محدود می‌کنند و بعضی نیتریت باقیمانده در محصول نهایی را. آزمون آزمایشگاهی همیشه نیتریت باقیمانده را اندازه می‌گیرد.

• نتیجه معمولاً بر حسب میلی‌گرم نیتریت سدیم در کیلوگرم محصول گزارش می‌شود، نه بر حسب یون نیتریت. اگر واحد گزارش با واحد استاندارد یکی نباشد، مقایسه اشتباه از آب درمی‌آید.

در بسیاری از مقررات، حد مجاز بسته به نوع محصول در محدودهٔ چند ده تا حدود ۱۵۰ میلی‌گرم در کیلوگرم قرار می‌گیرد و روند کلی جهانی به سمت کاهش این اعداد است. برای تولید و صدور گواهی در ایران، عدد مرجع را از آخرین ویرایش استاندارد ملی سوسیس و کالباس و ضوابط سازمان غذا و دارو بگیرید.

نیتریت باقیمانده در طول نگهداری محصول به‌تدریج کم می‌شود. پس نتیجهٔ آزمون روز تولید با نتیجهٔ همان محصول در قفسهٔ فروشگاه یکی نیست و تاریخ نمونه‌برداری باید همراه نتیجه ثبت شود.

روش‌های اندازه‌گیری نیتریت در فراورده‌های گوشتی

روش رنگ‌سنجی گریس (روش مرجع)

روش مرجع بین‌المللی برای این آزمون، استاندارد ISO 2918 است که بر پایهٔ واکنش گریس و قرائت رنگ با اسپکتروفوتومتر کار می‌کند. استانداردهای ملی بسیاری از کشورها، از جمله روش‌های رایج در آزمایشگاه‌های ایران، بر همین اساس تدوین شده‌اند. این روش ارزان، حساس و با تجهیزات معمول آزمایشگاه قابل اجراست.

روش‌های دستگاهی دیگر

کروماتوگرافی یونی و HPLC می‌توانند نیتریت و نیترات را هم‌زمان و با تداخل کمتر اندازه بگیرند، اما هزینه و تخصص بیشتری می‌خواهند و معمولاً در آزمایشگاه‌های مرجع یا پژوهشی استفاده می‌شوند. اگر با اصول این روش‌ها آشنا نیستید، مقالهٔ کروماتوگرافی چیست؟ اصول، انواع و کاربردها را ببینید. برای کار روزانهٔ کنترل کیفیت کارخانه، روش رنگ‌سنجی همچنان رایج‌ترین انتخاب است.

اصول شیمیایی واکنش گریس

واکنش گریس در دو مرحله رخ می‌دهد:

۱. دی‌آزوته‌شدن: نیتریت در محیط اسیدی با سولفانیل‌آمید واکنش می‌دهد و نمک دی‌آزونیوم می‌سازد.
۲. جفت‌شدن: این نمک با ان-(۱-نفتیل)اتیلن‌دی‌آمین (NED) ترکیب می‌شود و یک رنگ آزوی صورتی تا ارغوانی ایجاد می‌کند.

شدت این رنگ با غلظت نیتریت متناسب است و در طول موجی حدود ۵۴۰ نانومتر بیشترین جذب را دارد. اسپکتروفوتومتر جذب را می‌خواند و بر اساس قانون بیر-لامبرت غلظت از روی منحنی استاندارد محاسبه می‌شود.

مراحل اندازه‌گیری نیتریت در سوسیس و کالباس

آنچه در ادامه می‌آید خلاصهٔ گام‌های روش استاندارد است. مقادیر دقیق حجم‌ها، دماها و زمان‌ها را از متن استانداردی که آزمایشگاه‌تان بر اساس آن کار می‌کند بردارید.

نمونه‌برداری و همگن‌سازی

نیتریت به‌طور یکنواخت در محصول پخش نمی‌شود و نمونهٔ کوچک ممکن است نمایندهٔ کل بچ نباشد.

• از چند قطعه و چند نقطهٔ محصول نمونه بگیرید.

• پوشش (کیسینگ) سوسیس را جدا کنید.

• نمونه را با چرخ‌گوشت یا همزن آزمایشگاهی کاملاً همگن کنید.

• نمونهٔ همگن‌شده را در ظرف دربسته و در یخچال نگه دارید و هرچه زودتر آزمون کنید؛ نیتریت در دمای اتاق به‌سرعت کم می‌شود.

استخراج نیتریت با آب گرم

مقدار مشخصی از نمونهٔ همگن (در روش ISO حدود ۱۰ گرم) با دقت وزن و با آب گرم (حدود ۷۰ تا ۸۰ درجه) و محلول بوراکس اشباع مخلوط می‌شود. بوراکس محیط را کمی قلیایی نگه می‌دارد تا نیتریت در مرحلهٔ گرمادهی از دست نرود. سپس ظرف برای مدت مشخصی در حمام آب جوش قرار می‌گیرد تا نیتریت کامل از بافت گوشت وارد آب شود.

شفاف‌سازی عصاره با محلول‌های کارز

عصارهٔ گوشت پر از پروتئین و چربی است و کدورت آن نور را پراکنده می‌کند و جذب ظاهری را بالا می‌برد. برای حذف این مزاحم‌ها، بعد از خنک‌شدن، دو محلول کارز I (هگزاسیانوفرات پتاسیم) و کارز II (استات روی) به‌ترتیب اضافه می‌شوند. این دو با هم رسوبی می‌سازند که پروتئین و چربی را با خود ته‌نشین می‌کند. سپس محلول به حجم رسانده و صاف می‌شود تا عصاره‌ای شفاف به دست آید.

این مرحله تعیین‌کنندهٔ دقت آزمون است. عصارهٔ کدر، هر قدر هم که دستگاه دقیق باشد، نتیجهٔ بالاتر از واقع می‌دهد.

ایجاد رنگ و قرائت با اسپکتروفوتومتر

حجم مشخصی از عصارهٔ شفاف برداشته می‌شود، محلول سولفانیل‌آمید و اسید اضافه می‌شود و بعد از چند دقیقه، محلول NED. پس از زمان لازم برای تشکیل کامل رنگ، جذب در طول موج حدود ۵۴۰ نانومتر خوانده می‌شود. دستگاه با یک بلانک صفر می‌شود که همهٔ مراحل را بدون نمونه طی کرده است.

برای این قرائت به اسپکتروفوتومتری نیاز دارید که در ناحیهٔ مرئی دقت طول موج و پایداری خوبی داشته باشد. اسپکتروفوتومتر تک پرتو Vis-NIR مدل AURORA برای چنین آزمون‌های رنگ‌سنجی روزانه کافی است؛ اگر آزمایشگاه شما آزمون‌های UV هم دارد، مثل آنالیز روغن یا نوشیدنی، اسپکتروفوتومتر UV-Vis مدل AURORA با محدودهٔ ۱۹۰ تا ۱۱۰۰ نانومتر هر دو ناحیه را پوشش می‌دهد.

رسم منحنی استاندارد و محاسبهٔ نتیجه

با نیتریت سدیم خشک و خالص یک محلول مادر تهیه و از آن چند محلول استاندارد با غلظت‌های مختلف ساخته می‌شود. این استانداردها دقیقاً مثل نمونه رنگ‌آمیزی و خوانده می‌شوند و منحنی جذب بر حسب غلظت رسم می‌شود. منحنی خوب، خطی و با ضریب همبستگی بالا (معمولاً بالای ۰٫۹۹۵) است.

غلظت نیتریت در عصاره از روی منحنی خوانده و با در نظر گرفتن وزن نمونه، حجم نهایی و ضریب رقت، به میلی‌گرم نیتریت سدیم در کیلوگرم محصول تبدیل می‌شود:

نیتریت (mg/kg) = (غلظت خوانده‌شده × حجم نهایی عصاره × ضریب رقت) ÷ وزن نمونه

اگر جذب نمونه بالاتر از بالاترین استاندارد بود، عصاره را رقیق کنید؛ نتیجه را از بیرون محدودهٔ منحنی برون‌یابی نکنید.

نکات کنترلی برای اطمینان از صحت نتایج

کنترل‌های روزانهٔ آزمون

آزمایشگاهی که نتیجهٔ آن مبنای آزادسازی محصول یا گزارش رسمی است، باید با هر سری آزمون چند کنترل ساده انجام دهد:

• بلانک معرف: برای اطمینان از اینکه آب، معرف‌ها و ظروف آلوده به نیتریت نیستند.

• آزمون تکراری (Duplicate): هر نمونه حداقل دو بار از مرحلهٔ وزن‌کردن آزمون شود. اختلاف دو نتیجه باید در حد تکرارپذیری روش باشد.

• آزمون بازیابی (Spike): مقدار معلومی نیتریت به یک نمونه افزوده و درصد بازیابی محاسبه شود. بازیابی پایین معمولاً نشان می‌دهد نیتریت در مرحلهٔ استخراج از دست رفته است.

• استاندارد کنترل: یک استاندارد مستقل از منحنی، در شروع و پایان سری خوانده شود تا رانش دستگاه مشخص شود.

• ثبت سوابق: نتایج کنترل‌ها در نمودار کنترل ثبت شود تا روندهای غیرعادی زود دیده شوند.

این کنترل‌ها همان چیزی است که ممیزان در آزمایشگاه‌های دارای تأیید صلاحیت ISO 17025 بررسی می‌کنند.

خطاهای رایج و راه‌حل آن‌ها

عصارهٔ کدر: شفاف‌سازی ناقص با کارز، رایج‌ترین علت نتیجهٔ بالاتر از واقع است. ترتیب افزودن کارز I و II را رعایت کنید، اجازه دهید رسوب کامل تشکیل شود و از کاغذ صافی مناسب استفاده کنید.

از دست رفتن نیتریت: گرمادهی در محیط اسیدی یا تأخیر طولانی بین همگن‌سازی و آزمون، نیتریت را کاهش می‌دهد. محیط استخراج باید قلیایی ضعیف بماند و نمونه سرد نگه داشته شود.

آلودگی ظروف: شستن ظروف با اسید نیتریک یا استفاده از آب مقطر نامرغوب، نیتریت یا نیترات وارد آزمون می‌کند. ظروف را با آب بدون نیتریت آبکشی کنید و بلانک را جدی بگیرید.

زمان رنگ‌گیری نادرست: خواندن زودهنگام، رنگ ناقص و خواندن خیلی دیرهنگام، رنگ محوشده را اندازه می‌گیرد. زمان ذکرشده در روش را با تایمر رعایت کنید.

آسکوربات در فرمولاسیون: آسکوربات و اریتوربات به‌مرور نیتریت را مصرف می‌کنند. این یک خطای آزمون نیست، اما نشان می‌دهد چرا نیتریت باقیمانده با گذشت زمان کم می‌شود و آزمون باید سریع انجام شود.

خطاهای دستگاهی و کووت: کووت کثیف، بلانک نادرست یا گرم‌نشدن لامپ هم روی نتیجه اثر دارند. این موارد را با جزئیات در مقالهٔ خطای اسپکتروفوتومتر: ۹ علت رایج و راه‌حل آن‌ها بررسی کرده‌ایم.

چه تجهیزات و موادی برای این آزمون لازم است؟

• ترازوی آزمایشگاهی با دقت ۰٫۰۰۱ گرم

• چرخ‌گوشت یا همگن‌ساز آزمایشگاهی

• حمام آب جوش

• بالن حجمی، پیپت و کاغذ صافی

• اسپکتروفوتومتر مرئی و کووت مناسب با طول مسیر نوری مشخص

• معرف‌ها: بوراکس، کارز I و II، سولفانیل‌آمید، NED، اسید کلریدریک و نیتریت سدیم استاندارد

معرف‌ها را می‌توان در آزمایشگاه تهیه کرد یا به‌صورت آماده خرید. ریجنت‌های آماده مثل محلول ریجنت نیتریت (L.R) بر پایهٔ واکنش دی‌آزوته‌شدن کار می‌کنند و زمان آماده‌سازی و خطای ساخت معرف را کم می‌کنند. توجه داشته باشید که این ریجنت‌ها معمولاً برای نمونه‌های آبی طراحی شده‌اند؛ برای فراورده‌های گوشتی باید روی عصارهٔ شفاف‌شده با کارز و پس از رقیق‌سازی مناسب به کار روند و پیش از استفادهٔ روتین، با آزمون بازیابی در آزمایشگاه خودتان صحه‌گذاری شوند. برای آشنایی با معیارهای انتخاب ریجنت، مقالهٔ ریجنت اسپکتروفوتومتری چیست؟ را بخوانید.

سؤالات متداول

چرا نتیجهٔ آزمون نیتریت یک محصول در طول زمان کم می‌شود؟

نیتریت در محصول با پروتئین‌ها، میوگلوبین و آسکوربات واکنش می‌دهد و به ترکیبات دیگر تبدیل می‌شود. به همین دلیل نیتریت باقیمانده در طول ماندگاری کاهش پیدا می‌کند.

نتیجه را باید بر حسب نیتریت گزارش کرد یا نیتریت سدیم؟

در بیشتر استانداردهای فراورده‌های گوشتی، بر حسب نیتریت سدیم (NaNO₂). برای تبدیل یون نیتریت به نیتریت سدیم، عدد را در حدود ۱٫۵ ضرب کنید.

آیا می‌توان با کیت‌های تست آب، نیتریت سوسیس را اندازه گرفت؟

مستقیماً روی نمونه نه. ابتدا باید نیتریت استخراج و عصاره با کارز شفاف شود. پس از آن، ریجنت‌های رنگ‌سنجی مبتنی بر واکنش دی‌آزوته‌شدن قابل استفاده‌اند، به شرط صحه‌گذاری روش.

طول موج قرائت نیتریت به روش گریس چقدر است؟

حدود ۵۴۰ نانومتر؛ عدد دقیق در روش مورد استفاده ذکر شده است.

نیترات را هم با همین روش می‌شود اندازه گرفت؟

بله، به شرط اینکه نیترات ابتدا به نیتریت احیا شود؛ معمولاً با ستون کادمیوم. سپس کل نیتریت اندازه‌گیری و نیتریت اولیه از آن کم می‌شود.

جمع‌بندی

اندازه‌گیری نیتریت در فراورده‌های گوشتی با روش گریس، آزمونی ساده و ارزان است، اما دقت آن به جزئیات بستگی دارد: نمونه‌برداری و همگن‌سازی درست، استخراج در محیط مناسب، شفاف‌سازی کامل با کارز، رعایت زمان رنگ‌گیری و منحنی استاندارد معتبر. کنترل‌هایی مثل بلانک، آزمون تکراری و بازیابی، نتیجه را از یک عدد ساده به داده‌ای قابل دفاع تبدیل می‌کنند.

برای تولیدکنندگان سوسیس و کالباس، این آزمون هم ابزار تضمین ایمنی محصول است و هم راهی برای بهینه‌کردن مصرف نیتریت. با یک اسپکتروفوتومتر مرئی پایدار و معرف‌های باکیفیت، آن را می‌توان به‌راحتی در برنامهٔ روزانهٔ کنترل کیفیت جا داد.