کروماتوگرافی چیست؟ اصول، انواع و کاربردهای کروماتوگرافی

بسیاری از مواد، مخلوط های پیچیده ای از ترکیبات مختلف هستند و برای شناسایی یا اندازه گیری هر جزء، ابتدا باید اجزای آنها را از هم جدا کرد. یکی از قدرتمندترین و پرکاربردترین روش ها برای این کار، کروماتوگرافی است.

کروماتوگرافی (Chromatography) یک روش آزمایشگاهی برای جداسازی، شناسایی و اندازه گیری اجزای یک مخلوط است. این روش انواع مختلفی دارد، از جمله کروماتوگرافی گازی (GC)، کروماتوگرافی مایع (LC و HPLC) و کروماتوگرافی لایه نازک (TLC)، و در داروسازی، پزشکی قانونی، محیط زیست، صنایع غذایی، پتروشیمی و تحقیقات بیوشیمیایی کاربرد گسترده ای دارد.

در این مقاله با اصول کروماتوگرافی، اجزای آن، اشکال و انواع کروماتوگرافی، مکانیزم های جداسازی و کاربردهای آن آشنا می شوید.

تاریخچه کروماتوگرافی

کروماتوگرافی در اوایل قرن بیستم توسط میخائیل تسوت، گیاه شناس روس، ابداع شد. او رنگدانه های گیاهی را با عبور عصاره گیاه از یک ستون پر از پودر کربنات کلسیم از هم جدا کرد و چون رنگدانه ها به صورت نوارهای رنگی جدا می شدند، این روش را کروماتوگرافی به معنای «نوشتن با رنگ» نامید.

در دهه ۱۹۴۰، آرچر مارتین و ریچارد سینج کروماتوگرافی توزیعی را توسعه دادند و به خاطر آن در سال ۱۹۵۲ جایزه نوبل شیمی را دریافت کردند. پس از آن، روش هایی مانند کروماتوگرافی گازی و HPLC توسعه یافتند و کروماتوگرافی به یکی از ستون های اصلی شیمی تجزیه تبدیل شد.

کروماتوگرافی چیست؟

اساس کروماتوگرافی این است که اجزای مختلف یک مخلوط، میل ترکیبی متفاوتی نسبت به دو فاز دارند:

• فاز ساکن (Stationary Phase): فازی که ثابت است و حرکت نمی کند.

• فاز متحرک (Mobile Phase): فازی که از روی فاز ساکن عبور کرده و نمونه را با خود حمل می کند.

وقتی فاز متحرک نمونه را از روی فاز ساکن عبور می دهد، اجزایی که میل بیشتری به فاز ساکن دارند، کندتر حرکت می کنند و اجزایی که میل بیشتری به فاز متحرک دارند، سریع تر جلو می روند. به این ترتیب اجزای مخلوط به تدریج از هم جدا می شوند.

اجزا و مفاهیم اصلی کروماتوگرافی

فاز ساکن

فاز ساکن ماده ای با خواص شیمیایی مشخص است که جداسازی روی آن انجام می شود. فاز ساکن می تواند یک جامد جاذب مانند سیلیکاژل یا آلومینا، یا یک فیلم مایع نشانده شده روی یک پایه جامد باشد.

فاز متحرک

فاز متحرک یا شوینده (Eluent)، مایع یا گازی است که نمونه را از روی فاز ساکن عبور می دهد. فاز متحرک با هر جزء از مخلوط برهمکنش متفاوتی دارد و همین تفاوت به جداسازی کمک می کند. در کروماتوگرافی گازی، فاز متحرک یک گاز بی اثر مانند هلیوم یا نیتروژن است و در کروماتوگرافی مایع، یک حلال یا مخلوطی از حلال ها.

زمان بازداری و شویش

اجزایی که برهمکنش قوی تری با فاز ساکن دارند، مدت زمان بیشتری در سیستم می مانند. به مدت زمانی که یک جزء از لحظه تزریق تا خروج از ستون طی می کند، زمان بازداری (Retention Time) گفته می شود. هر ترکیب در شرایط مشخص، زمان بازداری ثابتی دارد که برای شناسایی آن استفاده می شود.

شویش (Elution) به فرایند خارج شدن اجزا از فاز ساکن گفته می شود. شویش را می توان با تغییر ترکیب فاز متحرک، سرعت جریان یا دما کنترل کرد.

آشکارسازی و کروماتوگرام

پس از جداسازی، اجزا توسط یک آشکارساز شناسایی می شوند. نتیجه به صورت نموداری به نام کروماتوگرام نمایش داده می شود که در آن هر جزء به شکل یک پیک دیده می شود:

• موقعیت پیک (زمان بازداری): برای شناسایی ترکیب

• سطح زیر پیک: برای تعیین مقدار و غلظت ترکیب

آشکارسازهای رایج عبارت اند از:

• در کروماتوگرافی گازی: آشکارساز یونش شعله ای (FID)، آشکارساز رسانایی گرمایی (TCD) و طیف سنج جرمی (MS)

• در کروماتوگرافی مایع: آشکارساز [UV-Vis]، آشکارساز فلورسانس، آشکارساز ضریب شکست (RI) که بر اساس اصول رفراکتومتر کار می کند، و طیف سنج جرمی

اشکال کروماتوگرافی

کروماتوگرافی از نظر شکل فاز ساکن به دو دسته کلی تقسیم می شود:

کروماتوگرافی صفحه ای

در کروماتوگرافی صفحه ای، فاز ساکن یک لایه نازک از ماده جاذب، مانند سیلیکاژل یا سلولز، روی یک صفحه شیشه ای، آلومینیومی یا پلاستیکی است. کروماتوگرافی لایه نازک (TLC) و کروماتوگرافی کاغذی از این نوع هستند.

1. نمونه به صورت یک نقطه کوچک نزدیک لبه پایینی صفحه قرار داده می شود.

2. لبه صفحه در حلال (فاز متحرک) قرار می گیرد و حلال با خاصیت مویینگی روی صفحه بالا می رود.

3. اجزای نمونه بسته به برهمکنش با فاز ساکن، با سرعت های متفاوت همراه حلال حرکت کرده و از هم جدا می شوند.

4. پس از خشک شدن صفحه، لکه های جدا شده با نور UV، رنگ آمیزی یا اسپری کردن یک ریجنت خاص قابل مشاهده می شوند.

برای شناسایی هر جزء، ضریب بازداری (Rf) محاسبه می شود:

Rf = مسافت طی شده توسط جزء / مسافت طی شده توسط جبهه حلال

مقدار Rf همیشه بین صفر و یک است و با مقایسه آن با ترکیبات مرجع، می توان اجزا را شناسایی کرد.

کروماتوگرافی ستونی

در کروماتوگرافی ستونی، فاز ساکن درون یک ستون شیشه ای یا فلزی قرار دارد. نمونه در ابتدای ستون وارد می شود و فاز متحرک با کمک نیروی گرانش یا فشار از ستون عبور داده می شود.

اجزایی که برهمکنش قوی تری با فاز ساکن دارند، دیرتر از ستون خارج می شوند و اجزایی با برهمکنش ضعیف تر، زودتر. اجزای خارج شده جمع آوری یا توسط آشکارساز اندازه گیری می شوند. کروماتوگرافی گازی و HPLC از نوع ستونی هستند.

انواع کروماتوگرافی بر اساس فاز متحرک

کروماتوگرافی گازی (GC)

در کروماتوگرافی گازی، فاز متحرک یک گاز حامل بی اثر است و نمونه پس از تبخیر، از یک ستون باریک و طولانی عبور می کند. GC برای جداسازی ترکیبات فرار و پایدار در برابر حرارت مناسب است و در آنالیز سوخت ها، گاز طبیعی، حلال ها، آلاینده های هوا، عطرها و ترکیب اسیدهای چرب روغن ها کاربرد گسترده ای دارد.

کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (HPLC)

در HPLC، فاز متحرک مایع با فشار بالا از ستونی پر از ذرات بسیار ریز عبور داده می شود. این روش برای ترکیبات غیرفرار یا حساس به حرارت، مانند داروها، پروتئین ها، ویتامین ها و افزودنی های غذایی، بسیار مناسب است و یکی از پرکاربردترین روش های آنالیز در صنایع دارویی است.

کروماتوگرافی لایه نازک (TLC)

TLC روشی ساده، سریع و ارزان است که برای بررسی پیشرفت واکنش های شیمیایی، کنترل خلوص ترکیبات و شناسایی اولیه مواد استفاده می شود.

مکانیزم های جداسازی در کروماتوگرافی

بسته به نوع برهمکنش بین اجزای نمونه و فاز ساکن، کروماتوگرافی مکانیزم های مختلفی دارد:

• جذب سطحی

• توزیع

• تبادل یونی

• میل ترکیبی

• کایرال

• اندازه مولکول

بیشتر کاربردهای تحلیلی امروزی، به ویژه در کروماتوگرافی گازی و HPLC فاز معکوس، بر پایه مکانیزم توزیع هستند.

کروماتوگرافی جذبی

در کروماتوگرافی جذبی، اجزای نمونه روی سطح فاز ساکن جامد جذب می شوند. اجزایی که جذب قوی تری دارند، دیرتر و اجزایی با جذب ضعیف تر، زودتر از ستون خارج می شوند. برای مثال، با یک فاز ساکن قطبی مانند سیلیکاژل، اجزای کم قطبی زودتر و اجزای قطبی تر دیرتر خارج می شوند.

فرایندهای اصلی در کروماتوگرافی جذبی عبارت اند از:

• جذب سطحی: چسبیدن مولکول ها به سطح فاز ساکن از طریق نیروهای بین مولکولی مانند نیروهای واندروالس، پیوند هیدروژنی و برهمکنش های دوقطبی

• واجذب: جدا شدن مولکول ها از سطح، زمانی که فاز متحرک برای برهمکنش با آنها با فاز ساکن رقابت می کند. هرچه برهمکنش ضعیف تر باشد، واجذب آسان تر و شویش سریع تر است.

• نفوذ: حرکت مولکول ها در منافذ فاز ساکن برای رسیدن به جایگاه های جذب

• تعادل: حالتی که سرعت جذب و واجذب برابر می شود و توزیع جزء بین دو فاز ثابت می ماند. این تعادل تحت تاثیر دما، فشار و ترکیب فاز متحرک است.

کروماتوگرافی توزیعی

در کروماتوگرافی توزیعی، جداسازی بر اساس حلالیت متفاوت اجزا در دو فاز انجام می شود. فاز ساکن معمولا یک فیلم مایع روی پایه جامد است و فاز متحرک مایع یا گاز.

هر جزء بر اساس ضریب توزیع خود بین دو فاز تقسیم می شود. اجزایی با ضریب توزیع بالاتر زمان بیشتری در فاز ساکن می مانند و زمان بازداری بیشتری دارند. با کنترل خواص دو فاز، دما و ابعاد ستون، می توان جداسازی را بهینه کرد.

کروماتوگرافی تبادل یونی

در کروماتوگرافی تبادل یونی، فاز ساکن گروه های باردار دارد و اجزا بر اساس بار الکتریکی خود جدا می شوند:

• تبادل گر کاتیونی: گروه های منفی دارد و کاتیون ها را نگه می دارد.

• تبادل گر آنیونی: گروه های مثبت دارد و آنیون ها را نگه می دارد.

اجزایی که بار مخالف فاز ساکن دارند، به دلیل جاذبه الکتروستاتیکی محکم نگه داشته می شوند و دیرتر خارج می شوند، اما اجزای هم بار یا بدون بار سریع تر عبور می کنند. با کنترل pH، قدرت یونی و غلظت بافر فاز متحرک، جداسازی بهینه می شود. این روش در تصفیه آب، آنالیز یون ها و خالص سازی پروتئین ها کاربرد دارد.

کروماتوگرافی میل ترکیبی

در کروماتوگرافی میل ترکیبی، یک لیگاند با میل ترکیبی و انتخاب پذیری بسیار بالا روی فاز ساکن تثبیت شده است. فقط مولکول هدف، مانند یک پروتئین، آنزیم یا آنتی بادی، به این لیگاند متصل می شود و بقیه اجزای نمونه از ستون عبور می کنند.

این اتصال بر اساس عواملی مانند تطابق شکل، توزیع بار و آبگریزی است و برگشت پذیر است. پس از شستن اجزای ناخواسته، با تغییر شرایطی مانند pH، قدرت یونی یا افزودن یک مولکول رقیب، اتصال ضعیف شده و مولکول هدف از ستون خارج می شود.

کروماتوگرافی میل ترکیبی در بیوشیمی، بیوتکنولوژی و صنایع دارویی برای خالص سازی پروتئین ها و آنتی بادی ها و کشف دارو بسیار پرکاربرد است.

کروماتوگرافی کایرال

انانتیومرها مولکول هایی هستند که تصویر آینه ای یکدیگرند. انانتیومرها در محیط معمولی خواص فیزیکی و شیمیایی یکسانی دارند و جدا کردن آنها با روش های معمولی ممکن نیست، اما در یک محیط کایرال رفتار متفاوتی نشان می دهند. یکی از روش های تشخیص آنها، اندازه گیری چرخش نوری با پلاریمتر است.

کروماتوگرافی کایرال از یک فاز ساکن کایرال استفاده می کند که سطح آن با انتخابگرهای کایرال، مانند مولکول های آلی کوچک یا پلیمرهای کایرال، اصلاح شده است. این فاز با هر انانتیومر برهمکنش متفاوتی دارد و در نتیجه، انانتیومرها با سرعت های متفاوت از ستون خارج می شوند.

این تفاوت از برهمکنش هایی مانند اثرات فضایی، پیوند هیدروژنی، نیروهای واندروالس، برهمکنش های دوقطبی و برهمکنش های π-π ناشی می شود و تحت تاثیر ترکیب حلال، دما و pH است. کروماتوگرافی کایرال در تعیین خلوص انانتیومری و کنترل کیفیت داروهای کایرال نقش حیاتی دارد.

کروماتوگرافی اندازه (ژل تراوایی)

کروماتوگرافی طرد اندازه که به آن کروماتوگرافی ژل تراوایی یا فیلتراسیون ژل نیز گفته می شود، اجزا را بر اساس اندازه و وزن مولکولی جدا می کند.

فاز ساکن از دانه ها یا ژل های متخلخل با اندازه منافذ کنترل شده تشکیل شده است. مولکول های کوچک می توانند وارد منافذ شوند و مسیر طولانی تری طی کنند، بنابراین دیرتر خارج می شوند. اما مولکول های بزرگ وارد منافذ نمی شوند و زودتر از ستون خارج می شوند.

بازده و وضوح این روش به اندازه ذرات و یکنواختی اندازه منافذ فاز ساکن بستگی دارد. برای تعیین وزن مولکولی نمونه های ناشناخته، یک منحنی کالیبراسیون با استانداردهایی با وزن مولکولی مشخص رسم می شود که لگاریتم وزن مولکولی را بر حسب حجم یا زمان شویش نشان می دهد. سپس وزن مولکولی نمونه با مقایسه با این منحنی تعیین می شود. این روش در آنالیز پلیمرها و پروتئین ها بسیار کاربرد دارد.

کاربردهای کروماتوگرافی

• صنایع دارویی: تعیین خلوص و غلظت داروها، شناسایی ناخالصی ها و کنترل کیفیت

• پزشکی قانونی: شناسایی مواد مخدر، سموم و داروها در نمونه های بیولوژیکی

• محیط زیست: اندازه گیری آفت کش ها، ترکیبات آلی فرار و آلاینده های آب، هوا و خاک

• صنایع غذایی: آنالیز افزودنی ها، ویتامین ها، آلاینده ها و ترکیب اسیدهای چرب

• نفت، گاز و پتروشیمی: تعیین ترکیب گاز طبیعی، سوخت ها و محصولات پتروشیمی

• بیوشیمی و بیوتکنولوژی: خالص سازی پروتئین ها، آنزیم ها و آنتی بادی ها

• آزمایشگاه های تشخیص طبی: اندازه گیری داروها و متابولیت ها در خون و ادرار

برای انجام کروماتوگرافی، به ریجنت ها و حلال هایی با خلوص بالا نیاز است که نقش مهمی در دقت نتایج دارند.

سوالات متداول درباره کروماتوگرافی

کروماتوگرافی چیست؟

روشی برای جداسازی، شناسایی و اندازه گیری اجزای یک مخلوط بر اساس تفاوت میل ترکیبی آنها به فاز ساکن و فاز متحرک.

تفاوت کروماتوگرافی گازی و HPLC چیست؟

در GC فاز متحرک گاز است و برای ترکیبات فرار استفاده می شود، اما در HPLC فاز متحرک مایع است و برای ترکیبات غیرفرار یا حساس به حرارت مناسب است.

Rf در کروماتوگرافی لایه نازک چیست؟

نسبت مسافت طی شده توسط یک جزء به مسافت طی شده توسط جبهه حلال که برای شناسایی ترکیبات استفاده می شود.

زمان بازداری چیست؟

مدت زمانی که یک جزء از لحظه تزریق تا خروج از ستون طی می کند و برای شناسایی آن استفاده می شود.

در کروماتوگرافی اندازه، کدام مولکول ها زودتر خارج می شوند؟

مولکول های بزرگ تر، چون وارد منافذ فاز ساکن نمی شوند و مسیر کوتاه تری طی می کنند.

جمع بندی

کروماتوگرافی یکی از مهم ترین روش های جداسازی و آنالیز در شیمی است که بر پایه تفاوت میل ترکیبی اجزای مخلوط به فاز ساکن و فاز متحرک کار می کند. این روش در اشکال صفحه ای و ستونی و در انواع گازی، مایع و لایه نازک انجام می شود و بر اساس مکانیزم های جذبی، توزیعی، تبادل یونی، میل ترکیبی، کایرال و اندازه مولکولی، امکان جداسازی طیف بسیار گسترده ای از مواد را فراهم می کند. کروماتوگرافی امروزه در داروسازی، پزشکی قانونی، محیط زیست، صنایع غذایی، پتروشیمی و بیوتکنولوژی ابزاری ضروری است.

منابع

• Separation Techniques: Chromatography

• Chiral HPLC for Efficient Resolution of Enantiomers