تفاوت اسپکتروفتومتر جذبی و بازتابی: اصول، انواع و کاربرد

اسپکتروفتومتر یا اسپکتروفوتومتر ابزاری نوری برای اندازه گیری شدت نور بر حسب طول موج است. این دستگاه مشخص می کند یک ماده چه مقدار از نور را در هر طول موج جذب، عبور یا بازتاب می کند و بر این اساس می توان غلظت، رنگ و سایر ویژگی های ماده را تعیین کرد.

اسپکتروفتومترها بر اساس نحوه برهمکنش نور با نمونه به دو گروه اصلی تقسیم می شوند: جذبی عبوری و بازتابی. این دو نوع از نظر ساختار، نوع نمونه و کاربرد تفاوت های مهمی دارند. در این مقاله این تفاوت ها را بررسی می کنیم تا بتوانید دستگاه مناسب کاربرد خود را انتخاب کنید. برای آشنایی کلی با اسپکتروفتومتر، اجزا و مشخصات فنی آن، مقاله دستگاه اسپکتروفتومتر را بخوانید.

چرا به اسپکتروفتومتر نیاز داریم؟

وقتی نور به یک ماده می تابد، بسته به نوع و حالت ماده، بخشی از آن بازتاب، بخشی جذب و بقیه عبور می کند. بخش مرئی نوری که به چشم ما می رسد، توسط مغز به عنوان رنگ ماده تفسیر می شود.

اما این تفسیر کیفی است و به عوامل زیادی بستگی دارد:

• شرایط بیننده: کوررنگی، خستگی، سن و شرایط پزشکی

• نوع منبع نور: نور خورشید، لامپ رشته ای، فلورسنت یا LED

به همین دلیل دو نفر ممکن است یک رنگ را متفاوت ببینند، یا دو نمونه در نور فروشگاه یکسان و در نور خورشید متفاوت به نظر برسند. این متغیرها مقایسه چشمی رنگ ها را بسیار دشوار می کنند. اسپکتروفتومتر با اندازه گیری کمی شدت نور بازتابی یا عبوری در هر طول موج، این عدم قطعیت را برطرف می کند.

اسپکتروفتومتر چگونه کار می کند؟

1. نور از یک منبع نور به نمونه تابیده می شود.

2. نور عبوری یا بازتابی از نمونه جمع آوری شده و از یک شکاف وارد بخش طیف سنج می شود.

3. یک توری پراش نور را به طول موج های مختلف تفکیک می کند؛ مانند جدا شدن رنگ های نور سفید در رنگین کمان.

4. نور تفکیک شده روی یک آشکارساز آرایه ای مانند CCD یا CMOS متمرکز می شود و شدت هر طول موج توسط یک پیکسل اندازه گیری می شود.

5. سیگنال دیجیتال شده و نرم افزار، طیف یا نتیجه نهایی (غلظت یا مختصات رنگ) را نمایش می دهد.

اسپکتروفتومتر جذبی عبوری

در اسپکتروفتومتر جذبی عبوری، نمونه که معمولا یک محلول یا ماده شفاف است، در یک کووت یا ویال قرار می گیرد و پرتو نوری از آن عبور می کند. آشکارساز در سمت دیگر نمونه، شدت نور عبوری را اندازه گیری می کند. با مقایسه شدت نور عبوری از نمونه با نور عبوری از شاهد، جذب نمونه محاسبه می شود که با غلظت ماده جاذب متناسب است.

محدوده طول موج رایج در اسپکتروفتومترهای جذبی UV-Vis-NIR حدود ۱۹۰ تا ۱۱۰۰ نانومتر است. اندازه گیری ها معمولا در دمای اتاق انجام می شوند، اما در برخی کاربردها مانند سنجش فعالیت آنزیم ها، از نگهدارنده کووت دمادار برای اندازه گیری در دمای کنترل شده استفاده می شود.

مبنای فیزیکی جذب نور

وقتی مولکول نور را جذب می کند، از یک تراز انرژی پایین تر به تراز بالاتری می رود. انرژی مولکول کوانتیده است و سه نوع تراز انرژی دارد:

• ترازهای انرژی الکترونی: به توزیع الکترون ها در مولکول مربوط هستند. اختلاف انرژی آنها با نور فرابنفش و مرئی برابر است و اساس طیف سنجی UV-Vis را تشکیل می دهند.

• ترازهای انرژی ارتعاشی: به ارتعاش اتم ها در مولکول مربوط هستند و اختلاف انرژی آنها با نور فروسرخ برابر است. برای آشنایی بیشتر، مقاله [طیف سنجی فروسرخ] را بخوانید.

• ترازهای انرژی چرخشی: به چرخش کل مولکول مربوط هستند و به گشتاور لختی مولکول بستگی دارند.

انرژی کل مولکول تقریبا برابر است با:

E = E(الکترونی) + E(ارتعاشی) + E(چرخشی)

انرژی فوتون جذب شده در یک گذار الکترونی برابر است با:

h × ν = E₂ − E₁

یک گذار الکترونی معمولا همراه با تغییر ترازهای ارتعاشی و چرخشی نیز هست. اگر فقط یک گذار بین دو تراز مشخص رخ می داد، طیف جذبی خطوط باریک داشت؛ اما چون گذارهای ارتعاشی و چرخشی زیادی همراه آن هستند و در مایعات و جامدات این خطوط پهن و روی هم می افتند، طیف جذبی مولکول ها در محلول به صورت نوارهای پهن دیده می شود.

قانون بیر لامبرت

قانون بیر لامبرت بیان می کند که جذب نور با غلظت ماده و طول مسیر نور در نمونه متناسب است:

A = ε × c × l

• A: جذب

• ε: ضریب جذب مولی

• c: غلظت

• l: طول مسیر نور (عرض کووت)

برای محاسبه جذب:

1. شدت نور عبوری از شاهد (I₀) اندازه گیری می شود.

2. شدت نور عبوری از نمونه (I) اندازه گیری می شود.

3. عبور و جذب محاسبه می شوند:

T = I / I₀

A = log (I₀ / I) = −log T

برای آشنایی کامل با این قانون، مقاله قانون بیر لامبرت را بخوانید.

انواع اسپکتروفتومتر جذبی

اسپکتروفتومترهای جذبی بر اساس محدوده طول موج انواع مختلفی دارند:

• اسپکتروفتومتر مرئی و UV-Vis: جذب نور مرئی و فرابنفش؛ رایج ترین نوع برای اندازه گیری غلظت در محلول ها

• اسپکتروفتومتر UV-Vis-NIR: با پوشش ناحیه فروسرخ نزدیک برای کاربردهای گسترده تر

• طیف سنج فروسرخ (FTIR): جذب نور فروسرخ توسط ارتعاشات پیوندها برای شناسایی ترکیبات

• طیف سنج جذب اتمی: جذب نور توسط اتم های آزاد برای اندازه گیری فلزات

• طیف سنج جذب اشعه ایکس: برای بررسی ساختار موضعی اطراف اتم ها

نکته: طیف سنجی رامان بر پایه پراکندگی نور است، نه جذب، و NMR بر پایه جذب امواج رادیویی در میدان مغناطیسی است و جزء اسپکتروفتومترهای نوری نیست.

اسپکتروفتومتر بازتابی

در اسپکتروفتومتر بازتابی، نمونه معمولا یک سطح جامد است و دستگاه مقدار نوری را که از سطح در هر طول موج بازتاب می شود، اندازه گیری می کند. این نوع دستگاه برای نمونه هایی مناسب است که نور از آنها عبور نمی کند؛ مانند پارچه ها، رنگ ها و پوشش ها، کاغذ، پلاستیک های مات، پودرها، مواد غذایی و بافت های زیستی.

درصد بازتاب

نتیجه اسپکتروفتومتر بازتابی معمولا به صورت درصد بازتاب (%R) بیان می شود:

‎%R = (شدت نور بازتابی / شدت نور تابیده) × 100

روش اندازه گیری:

1. ابتدا شدت نور بازتابی از یک استاندارد مرجع سفید با بازتاب مشخص و تقریبا ۱۰۰ درصدی، مانند سولفات باریم یا پلی تترافلوئورواتیلن فشرده، اندازه گیری می شود.

2. سپس نمونه جایگزین استاندارد شده و شدت نور بازتابی از آن اندازه گیری می شود.

3. درصد بازتاب از نسبت این دو محاسبه می شود.

کره انتگرال گیر

بسیاری از اسپکتروفتومترهای بازتابی یک کره انتگرال گیر دارند؛ یک کره توخالی که سطح داخلی آن با یک ماده سفید و بسیار بازتابنده پوشانده شده است. نور بازتاب شده از نمونه در همه جهات درون کره بارها بازتاب می شود و به طور یکنواخت به آشکارساز می رسد. به این ترتیب، دستگاه کل نور بازتابی را صرف نظر از جهت آن اندازه گیری می کند.

هندسه های اندازه گیری

• هندسه ۴۵ درجه و ۰ درجه: نور با زاویه ۴۵ درجه می تابد و نور بازتابی در راستای عمود اندازه گیری می شود. این هندسه نتیجه ای نزدیک به دید چشم ارائه می دهد.

• هندسه کره (d/8): نمونه با نور پخشی درون کره روشن می شود و نور با زاویه ۸ درجه اندازه گیری می شود. این هندسه می تواند بازتاب آینه ای (براقیت) را در اندازه گیری لحاظ کند یا آن را حذف کند و برای تطبیق رنگ در صنعت بسیار رایج است.

اندازه گیری رنگ

اسپکتروفتومترهای بازتابی رایج ترین ابزار اندازه گیری دقیق رنگ هستند. طیف بازتابی نمونه با استفاده از روابط استاندارد به مختصات رنگ، مانند سامانه CIELAB (پارامترهای روشنی، قرمزی سبزی و زردی آبی)، تبدیل می شود. اختلاف رنگ دو نمونه نیز با یک عدد به نام ΔE بیان می شود که برای کنترل کیفیت رنگ در تولید استفاده می شود.

انواع روش های طیف سنجی بازتابی

روش های بازتابی برای نمونه هایی استفاده می شوند که اندازه گیری آنها با روش جذب و عبور معمول دشوار است. این روش ها به دو دسته تقسیم می شوند:

• بازتاب داخلی: برهمکنش نور در مرز بین نمونه و یک ماده با ضریب شکست بیشتر بررسی می شود.

• بازتاب خارجی: نور بازتاب شده مستقیما از سطح نمونه اندازه گیری می شود.

طیف سنجی بازتاب داخلی (ATR)

طیف سنجی بازتاب داخلی یا بازتاب کلی تضعیف شده (ATR) روشی غیرمخرب برای جامدات، مایعات و پودرهاست که به آماده سازی نمونه کمی نیاز دارد یا اصلا نیاز ندارد. این روش بر پایه بازتاب کلی داخلی کار می کند:

1. نور از درون یک بلور با ضریب شکست بالا، مانند الماس، سلنید روی یا ژرمانیوم، با زاویه ای بیشتر از زاویه بحرانی به سطح بلور می رسد.

2. نور به طور کامل در سطح بلور بازتاب می شود.

3. با این حال، بخش کوچکی از میدان نور به صورت یک موج میرا به اندازه چند میکرومتر از سطح بلور به بیرون نفوذ می کند.

4. اگر نمونه با سطح بلور تماس داشته باشد، این موج میرا توسط نمونه جذب می شود و نور بازتابی تضعیف می شود.

5. با اندازه گیری این تضعیف در طول موج های مختلف، طیف نمونه به دست می آید.

شدت موج میرا با دور شدن از سطح بلور به صورت نمایی کاهش می یابد:

I = I₀ × exp(−z / dₚ)

که در آن z فاصله از سطح بلور و dₚ عمق نفوذ است که معمولا بین حدود نیم تا چند میکرومتر است. ATR امروزه رایج ترین روش اندازه گیری در طیف سنجی FTIR است.

طیف سنجی بازتاب خارجی

طیف سنجی بازتاب خارجی روشی غیرمخرب و بدون تماس است و دو نوع اصلی بازتاب را شامل می شود:

• بازتاب آینه ای (منظم): از سطوح صاف و صیقلی مانند آینه رخ می دهد و زاویه بازتاب برابر با زاویه تابش است. این روش برای اندازه گیری ضخامت لایه های نازک، ضریب شکست و بررسی پوشش ها روی سطوح فلزی بسیار مفید است.

• بازتاب پخشی: از سطوح ناهموار، مات و پودرها رخ می دهد و نور در همه جهات بازتاب می شود. در طیف سنجی بازتاب پخشی، اطلاعات ترکیب شیمیایی پودرها و مواد مات به دست می آید.

در عمل، بیشتر سطوح هر دو نوع بازتاب را با نسبت های متفاوت دارند.

رابطه بازتاب پخشی و غلظت

در طیف سنجی بازتاب پخشی، برخلاف قانون بیر لامبرت، رابطه خطی مستقیمی بین شدت نور بازتابی و غلظت وجود ندارد. برای تحلیل کمی، از تابع کوبلکا مونک استفاده می شود که داده های بازتاب را به کمیتی تقریبا متناسب با غلظت تبدیل می کند:

F(R) = (1 − R)² / 2R

که در آن R بازتاب یک نمونه بسیار ضخیم است.

مقایسه اسپکتروفتومتر جذبی و بازتابی

کاربردهای هر نوع

اسپکتروفتومتر جذبی عبوری:

• اندازه گیری غلظت مواد در آزمایشگاه های شیمی و زیست شناسی

• آنالیز آب و فاضلاب با ریجنت ها

• کنترل کیفیت در صنایع دارویی، غذایی و نوشیدنی

• اندازه گیری DNA و پروتئین ها

• آزمایش های پزشکی

اسپکتروفتومتر بازتابی:

• کنترل رنگ در صنایع نساجی، رنگ و پوشش، پلاستیک، کاغذ، چاپ و مواد غذایی

• تطبیق رنگ محصولات در تولیدهای مختلف

• بررسی آثار هنری و تشخیص اصالت

• پزشکی: بررسی اکسیژن رسانی بافت ها؛ هموگلوبین اکسیژن دار نور قرمز را بازتاب می دهد، اما هموگلوبین بدون اکسیژن نور قرمز بیشتری جذب می کند و تیره تر و مایل به آبی دیده می شود.

• اندازه گیری ضخامت لایه های نازک در صنعت نیمه رسانا و پوشش های اپتیکی

• شناسایی کانی ها و مواد پودری

کدام اسپکتروفتومتر را انتخاب کنیم؟

• اگر نمونه شما محلول یا شفاف است و می خواهید غلظت را اندازه گیری کنید، اسپکتروفتومتر جذبی عبوری را انتخاب کنید.

• اگر نمونه شما مات یا جامد است و می خواهید رنگ یا ویژگی های سطح را بررسی کنید، اسپکتروفتومتر بازتابی مناسب تر است.

• اگر با مواد نیمه شفاف مانند برخی پلاستیک ها کار می کنید، بسته به ضخامت و شفافیت نمونه، هر دو روش ممکن است مناسب باشند.

برای آشنایی با اسپکتروفتومترهای جذبی بلورآزما، به صفحه محصولات مراجعه کنید و برای انتخاب دستگاه مناسب، راهنمای خرید اسپکتروفتومتر را بخوانید.

سوالات متداول

تفاوت اسپکتروفتومتر جذبی و بازتابی چیست؟

اسپکتروفتومتر جذبی نور عبوری از نمونه های شفاف را برای اندازه گیری غلظت می سنجد، اما اسپکتروفتومتر بازتابی نور بازتابی از سطوح مات را برای اندازه گیری رنگ و ویژگی های سطح اندازه گیری می کند.

درصد بازتاب چگونه محاسبه می شود؟

از تقسیم شدت نور بازتابی از نمونه بر شدت نور بازتابی از یک استاندارد سفید مرجع، ضرب در صد.

کره انتگرال گیر چیست؟

کره ای توخالی با سطح داخلی سفید و بسیار بازتابنده که نور بازتابی از نمونه را در همه جهات جمع آوری و به طور یکنواخت به آشکارساز می رساند.

روش ATR چیست؟

روش بازتاب کلی تضعیف شده که در آن نمونه با سطح یک بلور تماس دارد و موج میرای نور بازتابی، توسط لایه سطحی نمونه جذب می شود؛ رایج ترین روش در FTIR است.

آیا در طیف سنجی بازتابی هم قانون بیر لامبرت برقرار است؟

در بازتاب پخشی رابطه خطی مستقیمی وجود ندارد و برای تحلیل کمی از تابع کوبلکا مونک استفاده می شود.

جمع بندی

اسپکتروفتومترها بر اساس نحوه برهمکنش نور با نمونه به دو نوع جذبی عبوری و بازتابی تقسیم می شوند. اسپکتروفتومتر جذبی عبوری نور عبوری از محلول ها و مواد شفاف را اندازه گیری می کند و با استفاده از قانون بیر لامبرت، غلظت مواد را تعیین می کند. اسپکتروفتومتر بازتابی نور بازتابی از سطوح جامد و مات را اندازه گیری می کند و بیشتر برای اندازه گیری رنگ و ویژگی های سطح استفاده می شود. روش های بازتابی شامل بازتاب داخلی (ATR) و بازتاب خارجی (آینه ای و پخشی) هستند. انتخاب نوع مناسب به نوع نمونه و هدف اندازه گیری بستگی دارد.

منابع

• J. Torrent and V. Barrón, Diffuse Reflectance Spectroscopy

• P. Blum, Physical Properties Handbook (PP Handbook), 1997