اسپکتروفوتومترهای نانودراپ
اسپکتروفوتومتر نانودراپ یکی از متداول ترین ابزارها برای تخمین غلظت و خلوص DNA و اسید نوکلئیک است. نانودراپ اسپکتروفوتومتری در محدوده UV-Vis است.
اسپکتروفوتومتر نانودراپ چیست و چه کاربردی دارد؟
اسپکتروفوتومتر نانودراپ چیست؟
در حال حاضر، اسپکتروفوتومتر نانودراپ یکی از متداول ترین و مفیدترین روش ها برای تخمین غلظت و خلوص DNA و اسید نوکلئیک ها، از طریق اندازه گیری جذبی میکرو حجم نمونه های مورد آنالیز است.
اسپکتروفوتومترهای نانودراپ، از گروه ابزارهای اسپکتروفوتومتری در محدوده UV-Vis هستند که شدت نور عبوری از نمونه را اندازه گیری کرده و آن را با شدت نور قبل از عبور از نمونه مقایسه می کنند و در نهایت، میزان غلظت مولکول موردنظر، بر اساس میزان جذب و عبور نور توسط مولکول بدست می آید.
از زمان ظهور نانودراپ، این دستگاه به طور گسترده در سراسر جهان مورد استفاده قرار گرفته است زیرا امروزه اندازه گیری های آزمایشگاهی با کیفیت و دقیق، امری ضروری شده است و آزمایشگاه ها باید از روش های آزمایش و کالیبراسیون استفاده کنند تا نیازهای مراجعین را برآورده نمایند.
آنالیز و تعیین دقیق و صحیح مقادیر DNA و اسید نوکلئیک ها برای طیف گسترده ای از کاربردهای زیست شناسی مولکولی بسیار مهم است و آزمایشگاه های خدمات تشخیصی نیز تقاضای فزاینده ای برای اینگونه آنالیزهای مولکولی دارند.
ویژگی های برجسته اسپکتروفوتومترهای نانودراپ
پیشرفت فناوری های فوتونیک و اسپکتروفوتومتری، منجر به تولید اسپکتروفوتومترهای نانودراپ میکرو حجمی شده است که فناوری قطعات اپتیکی و فیبر نوری را با خواص فیزیکی ذاتی نمونه ترکیب می کند تا حجم اندازه‌گیری را به طور چشمگیری کاهش دهد و نیاز به کووت ها را از بین ببرد.
برخلاف اسپکتروفوتومترهای معمولی که به حجم نمونه و کووت نسبتاً زیادی نیاز دارند، نانودراپ برای اندازه گیری و آنالیز نمونه های بسیار کم طراحی شده است (معمولاً 2-1 میکرولیتر).
به دلیل کم بودن مقادیر نمونه، جذب نمونه مستقیماً بر روی سطح اندازه‌گیری میکرو حجم اندازه گیری می شود و بنابراین، نیاز به کووت حذف می شود.
علاوه بر این، طراحی به گونه ای است که طول مسیر کوتاه تری ایجاد شده است تا محدوده دینامیکی قابل اندازه گیری غلظت های اسید نوکلئیک تا حد زیادی افزایش یابد و اساساً نیاز به انجام رقیق سازی را از بین می برد.
یکی از مزایای اصلی نانودراپ سرعت و سهولت استفاده از آن است. از آنجایی که به حجم نمونه کوچکی نیاز دارد و قطعات متحرک ندارد، اندازه گیری ها را می توان به سرعت و به راحتی با حداقل آماده سازی نمونه انجام داد.
علاوه بر این، این ابزارها حساسیت بسیار بالایی دارند و بنابراین، امکان اندازه گیری دقیق را حتی در غلظت های پایین نیز فراهم می کنند.
کاربرد اسپکتروفوتومترهای نانودراپ
برخی از کاربردهای اسپکتروفوتومتر نانودراپ عبارتند از:
1- تعیین کمیت DNA
یک اسپکتروفتومتر نانودراپ می تواند غلظت نمونه های DNA را به دقت اندازه گیری کند، که برای تکنیک های مختلف زیست شناسی مولکولی مانند PCR، شبیه سازی و توالی یابی مهم است.
بیشترین جذب نور برای DNA، در طول موج nm 260 است، اما لازم به ذکر است که محتویات دیگر یک نمونه DNA نیز ممکن است نور را در این طول موج جذب کنند (برخی از آلاینده ها مانند پروتئین ها و RNA).
در نتیجه، آماده سازی صحیح نمونه های DNA پیش از اندازه گیری های جذب، برای اطمینان از صحت و قابلیت اطمینان نتایج مهم است. آماده سازی نمونه DNA برای اندازه گیری جذب، طی مراحل زیر انجام می شود:
جداسازی DNA
اگر DNA قبلاً جداسازی نشده باشد، ابتدا باید با استفاده از روش مناسب از ماده بیولوژیکی مورد نظر استخراج شود.
خالص سازی DNA
برای حذف هر گونه آلودگی که ممکن است در دقت اندازه گیری جذب اختلال ایجاد کند،نمونه DNA باید خالص شود. این را می توان با استفاده از تکنیک هایی مانند رسوب اتانول، خالص سازی ستون یا الکتروفورز ژل انجام داد.
رقیق کردن DNA
نمونه DNA باید رقیق شود تا در محدوده خطی حد تشخیص اسپکتروفوتومتر قرار گیرد. در حالت ایده آل، قرائت چگالی نوری آن (OD) باید بین 0.1 و 1.0 باشد، که مقدار 1.0 مربوط به غلظت 50 میکروگرم بر میلی لیتر است.
رقیق سازی را می توان با استفاده از یک بافر مناسب مانند TE (Tris-HCl-EDTA) یا آب انجام داد.
صفر کردن نانودراپ
پیش از اندازه گیری نمونه DNA، اسپکتروفوتومتر باید با استفاده از یک محلول مرجع که فقط حاوی بافر رقت باشد، صفر شود. این کار اطمینان حاصل می کند که هر گونه جذب پس زمینه اسپکتروفوتومتر از اندازه گیری DNA کم شود.
اندازه گیری DNA
نمونه DNA رقیق شده را به دقت پیپت کنید و جذب را در 260 نانومتر اندازه گیری کنید. توجه به این نکته مهم است که این فقط یک دستورالعمل کلی است.
پروتکل خاص برای آماده سازی نمونه های DNA برای اندازه گیری جذب، بسته به کاربرد و نوع ماده بیولوژیکی مورد استفاده می تواند متفاوت باشد.
2- تعیین کمیت RNA
مشابه تعیین کمیت DNA، یک نانودراپ برای اندازه گیری غلظت نمونه های RNA استفاده می شود که برای تجزیه و تحلیل بیان ژن و سایر آزمایش های مبتنی بر RNA مهم است.
3- تعیین کمیت پروتئین
یک نانودراپ می‌تواند برای تعیین دقیق غلظت نمونه‌های پروتئین استفاده شود، که برای سنجش‌های مختلف بیوشیمیایی، مطالعات برهمکنش پروتئین-پروتئین و موارد دیگر مهم است.
پروتئین (اسیدنوکلئیک)، در طول موج nm280 بیشترین میزان جذب نور را دارد که عمدتاً به دلیل زنجیره های جانبی تریپتوفان (Tryptophan) و تیروزین (Tyrosine) است.
4- ارزیابی خلوص
اسپکتروفتومترهای نانودراپ برای ارزیابی خلوص نمونه های بیومولکولی با اندازه گیری نسبت جذب در طول موج های مختلف مفید است.
دقت اندازه گیری غلظت می تواند تحت تأثیر ناخالصی ها، مانند نمک ها یا پروتئین ها، در نمونه باشد. علاوه بر این، وجود RNA یا مولکول‌های دیگر می‌تواند در قرائت‌های جذب اختلال ایجاد کند، بنابراین مهم است که این عوامل را هنگام تفسیر نتایج خود در نظر بگیرید.
حتی پس از جداسازی DNA از یک ارگان، اغلب در محلول آن پروتئین وجود دارد که محکم به DNA متصل است و حذف کامل، همیشه امکان پذیر نیست.
زمانی که محلول حاوی هر دوی پروتئین و DNA باشد، خلوص DNA را می توان با بررسی نسبت دو مقدار جذب nm 260/nm 280 محاسبه کرد.
در این نسبت جذب، اعداد 8/1-7/1 تقریباً DNA پاک یا خالص را شناسایی می کنند، در حالی که مقادیر پایین تر ممکن است نشان دهنده آلودگی قابل توجه به پروتئین باشد.
با این وجود، نسبت جذب 260/280 همیشه نمایش دقیقی از خلوص DNA نیست و به دلیل تداخل، ارزیابی برخی از نمونه ها در طول موج nm 280 ممکن است بسیار دشوار باشد. به همین دلیل، پیوندهای پپتیدی، که در طول موج nm 228 جذب دارند، اغلب نشانگر ثابت تری از حضور پروتئین در نمونه هستند.
از طرف دیگر، نمک های فنول (Phenol) و گوانیدیوم (Guanidium) در طول موج nm 230 به شدت جذب می شوند. بنابراین، جذب بالا در این طول موج می تواند نشانه ای از انتقال هر یک از این ترکیبات به نمونه آزمایش باشد.
بنابراین، قرائت جذب اندازه گیری شده در nm 230 و nm 280، تخمین دقیق تری از پروتئین ها یا پپتیدهایی که ممکن است در نمونه های اسید نوکلئیک وجود داشته باشند، ارائه می دهد.
نمک های بافر نیز، به خصوص در طول موج های زیر nm 260، می توانند به طور قابل توجهی به قرائت جذب کمک کنند.
جذب در nm 320 نیز کدورت نمونه را اندازه گیری می کند. یک نمونه DNA با کیفیت خوب، باید برای نسبت جذب 260/280، مقدار 0/2-7/1 و برای نسبت جذب 260/320، مقداری بیشتر از 5/1 داشته باشد.
البته پروتئین و DNA هر دو نور UV را جذب می کنند، اما طیف جذب متفاوتی دارند. شکل زیر طیف جذب معمولی UV را برای پروتئین (BSA) و DNA نشان می دهد.
میکروبیولوژی
در میکروبیولوژی، یک اسپکتروفوتومتر نانودراپ برای اندازه گیری رشد باکتری ها یا قارچ ها در محیط های کشت استفاده می شود که می تواند به محققان در درک تأثیر عوامل محیطی بر رشد میکروبی کمک کند.
روش اندازه گیری با اسپکتروفوتومتر نانودراپ
همانطور که در بخش قبل مطرح شد، آنالیز اسپکتروفوتومتری مبتنی بر اصولی است که اسیدهای نوکلئیک یا DNA نور فرابنفش را در یک الگوی خاص جذب می کنند.
در مورد DNA و RNA، نمونه در معرض نور فرابنفش با طول موج مشخص قرار می گیرد و یک آشکارساز، نوری را که از نمونه عبور می کند، اندازه گیری می کند (همانند دیگر اسپکتروفوتومترها).
مقداری از اشعه فرابنفش عبور کرده و مقداری توسط DNA / RNA جذب می شود. هرچه نور بیشتری توسط نمونه جذب شود، نشان دهنده این است که غلظت ماده مورد نظر در نمونه بیشتر است.
بخش های اصلی یک اسپکتروفوتومتر نانودراپ
هولدر اندازه گیری نمونه
نمونه برای آنالیز در این قسمت قرار می گیرد که معمولاً حاوی یک سطح کوارتز یا یاقوت کبود است که نمونه روی آن پیپت می شود. سطح با نور روشن می شود و در نهایت، میزان جذب نمونه اندازه گیری می شود.
منبع نور
منبع نور معمولا یک لامپ LED (دیود ساطع کننده نور) یا لامپ زنون است که نور را برای نمونه در محفظه اندازه گیری فراهم می کند.
سیستم اپتیکی
سیستم نوری شامل لنزها، فیلترها و آینه هایی است که نور را پس از عبور از نمونه، به آشکارساز هدایت می کنند.
آشکارساز
آشکارساز شدت نور عبوری از نمونه اندازه گیری می کند، سیگنال نور را به سیگنال الکتریکی تبدیل می کند و سپس توسط نرم افزار ابزار پردازش می شود.
نمایشگر
بسیاری از مدل های نانودراپ دارای صفحه نمایش هستند که طیف نهایی را نمایش داده و به کاربر این امکان را می دهد تا بدون نیاز به کامپیوتر با دستگاه تعامل داشته باشند.
در اسپکتروفوتومترهای نانودراپ نمونه مستقیماً بر روی سطح اندازه گیری پیپت می شود و دیگر نیازی به استفاده از کووت نیست.
این کار با قرار دادن نمونه مستقیماً در بالای سطح تشخیص و استفاده از کشش سطحی برای ایجاد ستونی بین انتهای فیبرهای نوری انجام شده و بنابراین مسیر نوری اندازه گیری، شکل می گیرد.
مکانیزم عملکردی اسپکتروفوتومترهای نانودراپ
نانودراپ با تابش یک پرتو نور از طریق نمونه و اندازه گیری مقدار نوری که توسط نمونه در طول موج های مختلف جذب می شود، کار می کند. از طیف جذبی حاصل می‌توان برای تعیین غلظت نمونه و همچنین هرگونه ناخالصی یا آلاینده ای که ممکن است وجود داشته باشد نیز استفاده کرد.
قانون بیر-لامبرت یک اصل اساسی است که در اسپکتروفتومتری جذبی، از جمله در اسپکتروفوتومترهای نانودراپ استفاده می شود. این قانون رابطه بین غلظت ماده و مقدار نوری را که در یک طول موج خاص جذب می کند را توصیف می کند.
طبق قانون بیر-لامبرت، جذب (A) یک ماده با غلظت آن (c) و طول مسیر (l) نوری که از نمونه می گذرد، نسبت مستقیم دارد. از نظر ریاضی، این را می توان به صورت زیر بیان کرد:
A = εcl
جایی که ε جذب مولی است، ثابتی که توانایی مواد را برای جذب نور در طول موج معین را نشان می دهد.
در این قانون فرض بر این است که محلول به اندازه‌ای رقیق است که هیچ برهمکنش قابل توجهی بین مولکول ها وجود ندارد و نور فرودی تنها یک طول موج دارد.
در اسپکتروفوتومترهای نانودراپ، طول مسیر معمولاً 1 میلی‌متر تعیین می‌شود و جذب در طول موج خاصی اندازه‌گیری می شود (260 نانومتر برای اسیدهای نوکلئیک و 280 نانومتر برای پروتئین‌ها).
با اندازه گیری جذب یک نمونه در غلظت مشخص، می توان جذب مولی را محاسبه کرد و برای تعیین غلظت نمونه های ناشناخته استفاده کرد.
به طور کلی، اسپکتروفوتومتر نانودراپ یک ابزار همه کاره است که می تواند در طیف وسیعی از کاربردها در علوم زیستی و فراتر از آن مورد استفاده قرار گیرد.
امیدواریم که این مقاله مفید بوده است.
به شما کاربر عزیز پیشنهاد می کنیم که از بخش محصولات شرکت بلورآزما نیز دیدن نمایید و در صورت نیاز می توانید کاتالوگ آنها را دانلود کنید.
