نانودراپ چیست؟ اسپکتروفتومتر میکروحجم برای سنجش DNA و RNA

نانودراپ (NanoDrop) یا اسپکتروفتومتر میکروحجم، یکی از رایج ترین و کاربردی ترین ابزارها برای اندازه گیری غلظت و خلوص DNA، RNA و پروتئین در حجم های بسیار کم نمونه است. نانودراپ در اصل نام تجاری یک برند مشهور است، اما امروزه در آزمایشگاه ها به طور عام به همه اسپکتروفتومترهای میکروحجم گفته می شود.

این دستگاه از خانواده اسپکتروفتومترهای UV-Vis است. نانودراپ شدت نوری را که از نمونه عبور می کند اندازه گیری کرده و با شدت نور اولیه مقایسه می کند و بر اساس میزان جذب نور، غلظت ماده مورد نظر را محاسبه می کند.

تعیین دقیق مقدار DNA و اسیدهای نوکلئیک برای بسیاری از روش های زیست شناسی مولکولی ضروری است و آزمایشگاه های تحقیقاتی و تشخیصی تقاضای روزافزونی برای این آنالیزها دارند. به همین دلیل اسپکتروفتومترهای میکروحجم در سراسر جهان به طور گسترده استفاده می شوند.

ویژگی های اسپکتروفتومتر نانودراپ

پیشرفت فناوری های فوتونیک و نیازهای آزمایشگاه های زیستی، به ساخت اسپکتروفتومترهای میکروحجم منجر شد که حجم نمونه لازم را به شدت کاهش داده و نیاز به کووت را از بین برده اند.

حجم نمونه بسیار کم

برخلاف اسپکتروفتومترهای معمولی که به حجم نسبتا زیادی نمونه و کووت نیاز دارند، نانودراپ با حجم بسیار کمی از نمونه، معمولا ۱ تا ۲ میکرولیتر، کار می کند. این ویژگی برای نمونه های ارزشمند و کمیاب بسیار مهم است.

بدون نیاز به کووت

در نانودراپ، نمونه مستقیما روی سطح اندازه گیری قرار می گیرد و نیازی به کووت نیست. این کار هم سرعت را افزایش می دهد و هم خطر آلودگی و اتلاف نمونه را کاهش می دهد.

محدوده اندازه گیری گسترده بدون رقیق سازی

نانودراپ از طول مسیر نوری بسیار کوتاه استفاده می کند که حتی به صورت خودکار تغییر می کند. به این ترتیب، محدوده غلظتی که می توان مستقیما اندازه گیری کرد بسیار گسترده است و در بیشتر موارد نیازی به رقیق کردن نمونه های غلیظ نیست.

سرعت و سادگی

اندازه گیری با نانودراپ تنها چند ثانیه طول می کشد و به آماده سازی کمی نیاز دارد. همچنین حساسیت این دستگاه ها امکان اندازه گیری نمونه هایی با غلظت پایین را نیز فراهم می کند.

نانودراپ چگونه کار می کند؟

اصول اسپکتروفتومتری

اساس کار نانودراپ، مانند سایر اسپکتروفتومترها، برهمکنش نور و ماده است. وقتی نور به نمونه می تابد، بخشی از آن جذب و بقیه عبور می کند. اسیدهای نوکلئیک و پروتئین ها نور فرابنفش را با الگوی مشخصی جذب می کنند. هرچه نمونه نور بیشتری جذب کند، غلظت ماده مورد نظر بیشتر است.

قانون بیر لامبرت

رابطه بین جذب و غلظت با قانون بیر لامبرت بیان می شود:

A = ε × c × l

• A: جذب

• ε: ضریب جذب مولی، که توانایی ماده در جذب نور در یک طول موج مشخص را نشان می دهد

• c: غلظت ماده

• l: طول مسیر نوری در نمونه

این قانون برای محلول های رقیق معتبر است که در آنها مولکول ها برهمکنش قابل توجهی با هم ندارند.

تشکیل ستون نمونه با کشش سطحی

در نانودراپ، قطره نمونه روی انتهای یک فیبر نوری در سطح اندازه گیری قرار می گیرد. با بستن بازوی دستگاه، انتهای فیبر نوری دوم با قطره تماس پیدا می کند و کشش سطحی مایع یک ستون باریک بین دو فیبر ایجاد می کند. نور از این ستون عبور می کند و همین ستون، مسیر نوری اندازه گیری را تشکیل می دهد.

اجزای اسپکتروفتومتر نانودراپ

سطح اندازه گیری نمونه

نمونه روی این سطح پیپت می شود. انتهای فیبرهای نوری در این سطح قرار دارند و نور از طریق آنها به نمونه تابیده و جمع آوری می شود.

منبع نور

در بسیاری از اسپکتروفتومترهای میکروحجم از لامپ زنون فلاش استفاده می شود که نوری پرشدت در ناحیه فرابنفش و مرئی تولید می کند. برخی مدل ها از LED استفاده می کنند. برای آشنایی بیشتر، مقاله انواع منبع نوری را بخوانید.

سیستم اپتیکی و طیف سنج

نور پس از عبور از نمونه، از طریق فیبر نوری به یک طیف سنج کوچک می رسد که با یک توری پراش، نور را به طول موج های مختلف تجزیه می کند.

آشکارساز

یک آرایه آشکارساز، مانند سنسور CMOS یا CCD، شدت نور را در همه طول موج ها به طور همزمان اندازه گیری کرده و سیگنال را به داده دیجیتال تبدیل می کند.

نرم افزار و نمایشگر

بسیاری از مدل ها صفحه نمایش لمسی دارند که طیف جذبی، غلظت و نسبت های خلوص را بدون نیاز به کامپیوتر جداگانه نمایش می دهد.

کاربردهای نانودراپ

۱. اندازه گیری غلظت DNA

نانودراپ غلظت DNA را با دقت بالا اندازه گیری می کند؛ اطلاعاتی که برای روش هایی مانند PCR، همسانه سازی و توالی یابی ضروری است. DNA بیشترین جذب را در طول موج ۲۶۰ نانومتر دارد. غلظت اسیدهای نوکلئیک بر اساس این ضرایب محاسبه می شود (برای مسیر نوری یک سانتی متر):

• DNA دورشته ای: جذب ۱ برابر حدود ۵۰ میکروگرم بر میلی لیتر

• RNA: جذب ۱ برابر حدود ۴۰ میکروگرم بر میلی لیتر

• DNA تک رشته ای: جذب ۱ برابر حدود ۳۳ میکروگرم بر میلی لیتر

نکته مهم این است که برخی آلاینده ها، مانند پروتئین ها و RNA در نمونه DNA، نیز در ۲۶۰ نانومتر جذب دارند. بنابراین آماده سازی صحیح نمونه برای دقت نتایج اهمیت زیادی دارد.

مراحل آماده سازی و اندازه گیری DNA

1. استخراج DNA: DNA با روش مناسب از نمونه زیستی استخراج می شود.

2. خالص سازی DNA: آلاینده هایی که در اندازه گیری اختلال ایجاد می کنند، با روش هایی مانند رسوب با اتانول یا ستون های خالص سازی حذف می شوند.

3. تنظیم غلظت در صورت نیاز: در نانودراپ معمولا نیازی به رقیق کردن نیست. اما اگر از اسپکتروفتومتر معمولی با کووت یک سانتی متری استفاده می کنید، نمونه را طوری رقیق کنید که جذب آن بین حدود ۰.۱ تا ۱.۰ باشد. برای رقیق سازی از بافر مناسب مانند بافر TE یا آب استفاده می شود.

4. اندازه گیری شاهد (بلانک): پیش از اندازه گیری نمونه، دستگاه با همان بافری که DNA در آن حل شده صفر می شود تا جذب زمینه بافر از نتیجه کم شود.

5. اندازه گیری نمونه: حدود ۱ تا ۲ میکرولیتر از نمونه را روی سطح اندازه گیری پیپت کرده و جذب را اندازه گیری کنید.

این مراحل یک دستورالعمل کلی هستند و پروتکل دقیق بسته به نوع نمونه و کاربرد ممکن است متفاوت باشد.

۲. اندازه گیری غلظت RNA

نانودراپ برای اندازه گیری غلظت RNA نیز استفاده می شود که برای بررسی بیان ژن، RT-PCR و سایر آزمایش های مبتنی بر RNA اهمیت دارد. مراحل کار مشابه DNA است، اما ضریب محاسبه غلظت متفاوت است.

۳. اندازه گیری غلظت پروتئین

نانودراپ می تواند غلظت پروتئین ها را نیز اندازه گیری کند. پروتئین ها بیشترین جذب را در طول موج ۲۸۰ نانومتر دارند که عمدتا به دلیل وجود اسیدهای آمینه تریپتوفان و تیروزین است.

۴. ارزیابی خلوص نمونه

یکی از مهم ترین کاربردهای نانودراپ، ارزیابی خلوص اسیدهای نوکلئیک با استفاده از نسبت جذب در طول موج های مختلف است.

نسبت ۲۶۰ به ۲۸۰

حتی پس از استخراج DNA، ممکن است مقداری پروتئین در نمونه باقی بماند. چون پروتئین در ۲۸۰ نانومتر جذب بیشتری دارد، نسبت جذب ۲۶۰ به ۲۸۰ نشانه ای از آلودگی پروتئینی است:

• حدود ۱.۸: DNA خالص

• حدود ۲.۰: RNA خالص

• مقادیر کمتر: نشانه احتمالی آلودگی با پروتئین یا فنول (فنول در حدود ۲۷۰ نانومتر جذب قوی دارد)

نسبت ۲۶۰ به ۲۳۰

این نسبت، شاخص دوم خلوص است و برای نمونه های خالص معمولا بین ۲.۰ تا ۲.۲ است. مقدار کمتر نشان دهنده آلودگی با موادی است که در حدود ۲۳۰ نانومتر جذب دارند؛ مانند نمک های گوانیدین که در کیت های استخراج استفاده می شوند، کربوهیدرات ها، EDTA و پیوندهای پپتیدی پروتئین ها.

جذب زمینه و کدورت

جذب در طول موج های بالاتر، مانند ۳۲۰ یا ۳۴۰ نانومتر، که در آن اسیدهای نوکلئیک جذبی ندارند، برای بررسی کدورت و تصحیح خط پایه استفاده می شود. نمک های بافر نیز ممکن است در طول موج های کوتاه، به ویژه زیر ۲۶۰ نانومتر، روی جذب اثر بگذارند.

توجه داشته باشید که این نسبت ها نشانه خلوص هستند و همیشه تصویر کاملی از کیفیت نمونه ارائه نمی دهند. برای مثال، نسبت ۲۶۰ به ۲۸۰ به آلودگی کم پروتئین حساسیت زیادی ندارد. طیف جذبی کامل نمونه نیز اطلاعات ارزشمندی درباره وجود آلاینده ها ارائه می دهد.

۵. میکروبیولوژی

برخی اسپکتروفتومترهای میکروحجم حالت کووت نیز دارند و می توانند کدورت کشت میکروبی را در طول موج ۶۰۰ نانومتر (OD600) اندازه گیری کنند. این اندازه گیری برای بررسی رشد باکتری ها و قارچ ها استفاده می شود.

نکات اندازه گیری دقیق با نانودراپ

• تمیز کردن سطح اندازه گیری: پیش و پس از هر اندازه گیری، سطح را با دستمال بدون پرز و آب مقطر تمیز کنید.

• شاهد مناسب: دستگاه را با همان بافری صفر کنید که نمونه در آن حل شده است.

• مخلوط کردن نمونه: پیش از برداشتن نمونه، آن را به آرامی مخلوط کنید، چون DNA ممکن است به طور یکنواخت در محلول پخش نشده باشد.

• پرهیز از حباب: حباب هوا در قطره نمونه باعث خطای اندازه گیری می شود.

• تکرار اندازه گیری: برای اطمینان، هر نمونه را دو یا سه بار اندازه گیری کنید.

• غلظت های بسیار پایین: برای نمونه های بسیار رقیق، روش های فلوریمتری با رنگ های اختصاصی اسید نوکلئیک، حساسیت و اختصاصیت بیشتری دارند.

سوالات متداول درباره نانودراپ

نانودراپ چیست؟

اسپکتروفتومتر میکروحجمی که غلظت و خلوص DNA، RNA و پروتئین را با ۱ تا ۲ میکرولیتر نمونه و بدون نیاز به کووت اندازه گیری می کند.

نسبت ۲۶۰ به ۲۸۰ مناسب برای DNA چقدر است؟

حدود ۱.۸ برای DNA خالص و حدود ۲.۰ برای RNA خالص.

نسبت ۲۶۰ به ۲۳۰ پایین نشانه چیست؟

نشانه آلودگی با موادی مانند نمک های گوانیدین، کربوهیدرات ها، EDTA یا فنول.

چرا DNA در ۲۶۰ نانومتر اندازه گیری می شود؟

چون بازهای آلی DNA بیشترین جذب نور فرابنفش را در این طول موج دارند.

آیا در نانودراپ نیاز به رقیق کردن نمونه است؟

معمولا خیر، چون طول مسیر نوری بسیار کوتاه است و محدوده اندازه گیری گسترده ای دارد.

جمع بندی

نانودراپ یا اسپکتروفتومتر میکروحجم، ابزاری سریع و کارآمد برای اندازه گیری غلظت و خلوص DNA، RNA و پروتئین با حجم بسیار کم نمونه است. این دستگاه بر اساس قانون بیر لامبرت کار می کند و با تشکیل یک ستون مایع بین دو فیبر نوری، نیاز به کووت و رقیق سازی را از بین می برد. نسبت های جذب ۲۶۰ به ۲۸۰ و ۲۶۰ به ۲۳۰ نیز اطلاعات ارزشمندی درباره آلودگی های احتمالی نمونه ارائه می دهند.

برای آشنایی با اسپکتروفتومترها و معیارهای انتخاب آنها، راهنمای خرید اسپکتروفتومتر را بخوانید و از بخش محصولات بلورآزما دیدن کنید.

منابع

• NanoDrop Microvolume Quantitation of Nucleic Acids