کاربرد اسپکتروفتومتر در آنالیز رنگدانه های گیاهی: کلروفیل، کاروتنوئید و آنتوسیانین

اسپکتروفتومتری یکی از روش های قدرتمند و پرکاربرد برای بررسی ترکیبات شیمیایی گیاهان است. این روش بر پایه برهمکنش نور و ماده کار می کند و اطلاعات ارزشمندی درباره ترکیب و غلظت اجزای گیاهی ارائه می دهد.

اسپکتروفتومتری در زمینه هایی مانند بررسی بافت های گیاهی، ارزیابی وضعیت محصولات زراعی، مطالعه پاسخ گیاه به تنش های محیطی، ارزیابی بهره وری گیاهان و کنترل کیفیت رنگ های طبیعی کاربرد دارد. با این روش می توان پروتئین ها، متابولیت ها و به ویژه رنگدانه های گیاهی را اندازه گیری کرد.

در این مقاله به طور ویژه به رنگدانه ها یا رنگیزه های فتوسنتزی گیاهان و روش اندازه گیری آنها با اسپکتروفتومتر می پردازیم.

فتوسنتز چیست؟

فتوسنتز (یا فوتوسنتز) فرایندی است که در آن گیاهان، جلبک ها و برخی باکتری ها با استفاده از انرژی نور خورشید، دی اکسید کربن و آب را به گلوکز و اکسیژن تبدیل می کنند:

6CO₂ + 6H₂O + نور ← C₆H₁₂O₆ + 6O₂

در این فرایند، انرژی نور خورشید به انرژی شیمیایی تبدیل شده و در پیوندهای مولکول گلوکز ذخیره می شود. این انرژی شیمیایی، سوخت فرایندهای سلولی را تامین می کند و پایه زنجیره غذایی و حیات روی زمین است. گلوکز علاوه بر تامین انرژی، واحد سازنده کربوهیدرات های پیچیده تر مانند نشاسته و سلولز نیز هست.

رنگیزه های فتوسنتزی چیست؟

رنگیزه ها یا رنگدانه های گیاهی مولکول هایی هستند که طول موج های مشخصی از نور مرئی را جذب می کنند. رنگیزه های فتوسنتزی آن دسته از رنگیزه ها هستند که انرژی نور را برای انجام فتوسنتز جذب می کنند.

رنگیزه ها همه طول موج های نور را جذب نمی کنند. طول موج هایی که جذب نمی شوند، بازتاب می شوند و به چشم ما می رسند. همین نور بازتاب شده، رنگ گیاه را تعیین می کند. برای مثال، برگ ها سبز دیده می شوند، چون کلروفیل نور آبی و قرمز را جذب و نور سبز را بازتاب می دهد.

انواع رنگدانه های گیاهی

رنگ یکی از مهم ترین ویژگی های گیاهان است و بسیاری از گیاهان منبع رنگ های طبیعی هستند. این رنگدانه ها علاوه بر نقش در فتوسنتز، به دلیل خواص آنتی اکسیدانی و فواید سلامتی، در صنایع غذایی، دارویی و آرایشی کاربرد گسترده ای دارند و کنترل کیفیت آنها اهمیت زیادی دارد. مهم ترین رنگدانه های گیاهی عبارت اند از:

در پاییز، تولید کلروفیل در برگ ها متوقف و کلروفیل موجود تجزیه می شود. در نتیجه رنگ زرد و نارنجی کاروتنوئیدها که پیش تر زیر رنگ سبز پنهان بود، نمایان می شود و در برخی گیاهان، آنتوسیانین های قرمز نیز ساخته می شوند. همین تغییرات، رنگ های زیبای پاییزی را ایجاد می کنند.

کلروفیل

کلروفیل مهم ترین رنگیزه فتوسنتزی است که انرژی نور را جذب کرده و آن را به فرایند تبدیل انرژی در فتوسنتز منتقل می کند. گیاهان عالی دو نوع اصلی کلروفیل دارند:

• کلروفیل a: رنگیزه اصلی فتوسنتز که در همه موجودات فتوسنتزکننده اکسیژن ساز وجود دارد و رنگ سبز آبی دارد.

• کلروفیل b: رنگیزه کمکی با رنگ سبز زرد که دامنه جذب نور را گسترش می دهد.

کلروفیل ها نور آبی و قرمز را به شدت جذب می کنند و نور سبز را بازتاب می دهند. مقدار کلروفیل تعیین کننده مهمی برای سرعت فتوسنتز و بهره وری گیاه است. محتوای کلروفیل با تغییر شرایط محیطی، مانند کمبود نیتروژن، خشکی یا سایر تنش ها، تغییر می کند. به همین دلیل اندازه گیری کلروفیل یک شاخص مهم برای ارزیابی سلامت و وضعیت تغذیه ای گیاه است. مقدار و رنگ کلروفیل تا حدی نیز توسط ژن ها کنترل می شود و در برنامه های اصلاح نژاد گیاهان بررسی می شود.

کاروتنوئیدها

کاروتنوئیدها گروه بزرگی از رنگدانه ها هستند که در گیاهان، جلبک ها و برخی باکتری ها وجود دارند و رنگ های زرد، نارنجی و قرمز ایجاد می کنند. کاروتنوئیدها چند نقش مهم دارند:

• به عنوان رنگیزه کمکی، نوری را جذب می کنند که کلروفیل به خوبی جذب نمی کند و انرژی آن را به کلروفیل منتقل می کنند.

• از دستگاه فتوسنتزی در برابر نور بیش از حد و آسیب اکسیداتیو محافظت می کنند.

• آنتی اکسیدان هستند و پیش ساز برخی هورمون های گیاهی هستند.

جانوران نمی توانند کاروتنوئید بسازند و آن را از طریق غذا دریافت می کنند. برای مثال، بتاکاروتن موجود در هویج در بدن به ویتامین A تبدیل می شود.

کاروتنوئیدها به دو گروه تقسیم می شوند:

• کاروتن ها: هیدروکربن های بدون اکسیژن با رنگ نارنجی؛ مانند بتاکاروتن در هویج و لیکوپن در گوجه فرنگی

• زانتوفیل ها: کاروتنوئیدهای دارای اکسیژن با رنگ زرد؛ مانند لوتئین و زآگزانتین

آنتوسیانین ها

آنتوسیانین ها رنگدانه هایی از خانواده فلاونوئیدها و ترکیبات پلی فنولی هستند که رنگ های صورتی، قرمز، بنفش و آبی را در گل ها، میوه ها و سبزیجات، مانند انگور، توت فرنگی، کلم قرمز و زرشک، ایجاد می کنند. آنتوسیانین ها در جذب گرده افشان ها، محافظت در برابر نور و سازوکارهای دفاعی گیاه نقش دارند.

از نظر ساختاری، آنتوسیانین ها از اتصال قندها به مولکول هایی به نام آنتوسیانیدین تشکیل شده اند. رنگ آنتوسیانین ها به pH بسیار حساس است:

• در محیط اسیدی: قرمز

• در محیط خنثی: بنفش

• در محیط قلیایی: آبی تا سبز

به همین دلیل عصاره کلم قرمز به عنوان شناساگر pH طبیعی استفاده می شود. آنتوسیانین ها همچنین به نور، دما و یون های فلزی حساس هستند و پایداری آنها برای استفاده به عنوان رنگ خوراکی طبیعی چالش برانگیز است.

بتالائین ها

بتالائین ها رنگدانه های محلول در آب هستند که نقشی مشابه آنتوسیانین ها دارند، اما ساختار شیمیایی متفاوتی دارند و حاوی نیتروژن هستند. بتالائین ها فقط در گیاهان راسته میخک سانان (کاریوفیلال ها)، مانند چغندر قرمز، تاج خروس و کاکتوس ها، وجود دارند. نکته جالب این است که بتالائین ها و آنتوسیانین ها هرگز در یک گیاه با هم دیده نمی شوند.

بتالائین ها دو گروه دارند:

• بتاسیانین ها: رنگ قرمز بنفش با بیشینه جذب حدود ۵۳۵ تا ۵۴۰ نانومتر؛ مانند بتانین در چغندر قرمز

• بتاگزانتین ها: رنگ زرد با بیشینه جذب حدود ۴۸۰ نانومتر

بتالائین ها به عنوان رنگ خوراکی طبیعی (مانند رنگ چغندر) استفاده می شوند.

اندازه گیری رنگدانه های گیاهی با اسپکتروفتومتر

روش استخراج و اسپکتروفتومتری جذبی

رایج ترین روش آزمایشگاهی اندازه گیری رنگدانه ها، استخراج آنها با حلال و اندازه گیری جذب عصاره با دستگاه اسپکتروفوتومتر است. چون هر رنگدانه در طول موج های مشخصی جذب دارد، با اندازه گیری جذب در چند طول موج و استفاده از معادلات استاندارد، غلظت هر رنگدانه محاسبه می شود.

مراحل کلی اندازه گیری کلروفیل و کاروتنوئید:

1. مقدار مشخصی از برگ تازه وزن می شود.

2. برگ با حلال آلی، مانند استون ۸۰ درصد، اتانول یا متانول، در هاون یا همگن ساز ساییده می شود. گاهی مقدار کمی کربنات منیزیم اضافه می شود تا از تخریب کلروفیل جلوگیری شود.

3. عصاره سانتریفیوژ یا صاف شده و با همان حلال به حجم مشخصی رسانده می شود.

4. دستگاه با حلال خالص به عنوان شاهد صفر می شود.

5. جذب عصاره در طول موج های مشخص اندازه گیری می شود.

6. غلظت رنگدانه ها با معادلات استاندارد محاسبه می شود.

برای مثال، در یکی از روش های رایج (روش لیختن تالر) برای عصاره استون ۸۰ درصد، غلظت ها بر حسب میکروگرم بر میلی لیتر از این روابط به دست می آید:

کلروفیل a = 12.25 × A663.2 − 2.79 × A646.8

کلروفیل b = 21.50 × A646.8 − 5.10 × A663.2

کاروتنوئیدها = (1000 × A470 − 1.82 × کلروفیل a − 85.02 × کلروفیل b) / 198

که در آن A جذب در طول موج مشخص شده است. ضرایب این معادلات به نوع حلال بستگی دارند و برای هر حلال باید از معادلات مخصوص همان حلال استفاده کرد.

نکات مهم:

• کلروفیل به نور و گرما حساس است؛ استخراج و اندازه گیری را در نور کم و دمای پایین و با سرعت انجام دهید.

• عصاره باید کاملا شفاف باشد، چون کدورت جذب را به طور کاذب افزایش می دهد.

• دقت طول موج دستگاه اهمیت زیادی دارد، چون قله های کلروفیل باریک هستند.

اندازه گیری آنتوسیانین: آنتوسیانین ها معمولا با متانول یا اتانول اسیدی یا آب اسیدی استخراج می شوند. یک روش رایج، روش تفاضل pH است: جذب عصاره در دو بافر با pH حدود ۱ و pH حدود ۴.۵، در طول موج حدود ۵۲۰ نانومتر و ۷۰۰ نانومتر (برای تصحیح کدورت) اندازه گیری می شود. چون رنگ آنتوسیانین با pH تغییر می کند اما رنگ ترکیبات مزاحم تغییر نمی کند، اختلاف جذب دو بافر فقط به آنتوسیانین ها مربوط است.

روش های غیرمخرب

روش استخراج دقیق است، اما مخرب است، زمان بر است و برای بررسی تعداد زیاد نمونه در مزرعه یا برنامه های اصلاح نژاد مناسب نیست. به همین دلیل روش های غیرمخرب نیز توسعه یافته اند:

• کلروفیل سنج های دستی: با اندازه گیری عبور نور قرمز و فروسرخ نزدیک از برگ، شاخصی از مقدار کلروفیل را در چند ثانیه و بدون آسیب به برگ ارائه می دهند.

• طیف سنجی بازتابی: طیف نور بازتاب شده از برگ زنده اندازه گیری می شود. چون کلروفیل نور قرمز را جذب و نور فروسرخ نزدیک را بازتاب می دهد، از نسبت این بازتاب ها می توان وضعیت پوشش گیاهی را تعیین کرد. همین اصل در شاخص های پوشش گیاهی مانند NDVI که با تصاویر ماهواره ای محاسبه می شوند، به کار می رود.

• رنگ سنجی: اندازه گیری رنگ برگ یا محصول با سامانه رنگ CIELAB (پارامترهای روشنی، قرمزی و زردی) که سریع است اما به جای غلظت رنگدانه، رنگ ظاهری را نشان می دهد.

طیف سنجی فروسرخ نزدیک (NIR)

طیف سنجی فروسرخ نزدیک یکی از روش های بازتابی رایج برای تخمین ترکیبات شیمیایی گیاهان است. این روش بر پایه هماهنگ های بالاتر [ارتعاش مولکولی] پیوندهای C−H، N−H و O−H در اجزای زیستی کار می کند.

طیف NIR شامل باندهای پهن و همپوشان است و تفسیر مستقیم آن دشوار است. به همین دلیل از روش های شیمی سنجی (مدل سازی آماری) استفاده می شود:

1. طیف تعداد زیادی نمونه ثبت و مقدار رنگدانه یا ترکیب مورد نظر آنها با روش مرجع، مانند استخراج و اسپکتروفتومتری، اندازه گیری می شود.

2. یک مدل کالیبراسیون بین طیف و غلظت ساخته می شود.

3. مدل با نمونه های مستقل اعتبارسنجی می شود.

4. سپس مدل برای پیش بینی سریع مقدار ترکیبات در نمونه های جدید، فقط با ثبت طیف آنها، استفاده می شود.

طیف سنجی NIR سریع، غیرمخرب و مناسب غربالگری تعداد زیاد نمونه در برنامه های اصلاح نژاد و کنترل کیفیت است. روش های دیگری مانند طیف سنجی رامان نیز برای بررسی رنگدانه های برگ در پژوهش ها استفاده شده اند.

کاربردهای آنالیز رنگدانه های گیاهی

• کشاورزی: ارزیابی وضعیت تغذیه نیتروژن، تنش خشکی و سلامت محصولات

• فیزیولوژی گیاهی: مطالعه پاسخ گیاهان به نور، دما و تنش های محیطی

• اصلاح نژاد: انتخاب ارقام با فتوسنتز بهتر یا رنگ مطلوب

• صنایع غذایی: کنترل کیفیت رنگ های طبیعی، آب میوه ها و محصولاتی مانند روغن زیتون که کلروفیل و کاروتنوئید آنها شاخص کیفیت است

• صنایع دارویی و مکمل ها: اندازه گیری ترکیبات آنتی اکسیدانی مانند کاروتنوئیدها و آنتوسیانین ها

• محیط زیست: اندازه گیری کلروفیل جلبک ها در آب به عنوان شاخص مغذی شدن آب

• سنجش از دور: پایش پوشش گیاهی مزارع و جنگل ها با ماهواره

ترکیبات رنگی برخی ادویه ها نیز با اسپکتروفتومتری اندازه گیری می شوند؛ برای مثال کروسین که از مشتقات کاروتنوئیدهاست و رنگ زعفران را ایجاد می کند. برای آشنایی بیشتر، مقاله آنالیز زعفران با اسپکتروفتومتر را بخوانید.

سوالات متداول درباره رنگدانه های گیاهی

رنگیزه های فتوسنتزی چیست؟

مولکول هایی مانند کلروفیل و کاروتنوئیدها که نور را جذب کرده و انرژی آن را برای انجام فتوسنتز به کار می گیرند.

چرا برگ ها سبز هستند؟

چون کلروفیل نور آبی و قرمز را جذب و نور سبز را بازتاب می دهد.

کلروفیل در چه طول موجی جذب دارد؟

در ناحیه آبی، حدود ۴۳۰ تا ۴۵۰ نانومتر، و در ناحیه قرمز، حدود ۶۴۰ تا ۶۶۵ نانومتر.

کلروفیل را چگونه با اسپکتروفتومتر اندازه گیری می کنند؟

کلروفیل با حلالی مانند استون ۸۰ درصد از برگ استخراج می شود، جذب عصاره در طول موج های مشخص اندازه گیری می شود و غلظت با معادلات استاندارد محاسبه می شود.

چرا رنگ برگ ها در پاییز تغییر می کند؟

چون کلروفیل تجزیه می شود و رنگ زرد و نارنجی کاروتنوئیدها نمایان می شود و در برخی گیاهان آنتوسیانین های قرمز نیز ساخته می شوند.

جمع بندی

رنگیزه های گیاهی، شامل کلروفیل ها، کاروتنوئیدها، آنتوسیانین ها و بتالائین ها، طول موج های مشخصی از نور را جذب می کنند و علاوه بر نقش در فتوسنتز و رنگ گیاهان، در صنایع غذایی و دارویی اهمیت زیادی دارند. اسپکتروفتومتری روشی سریع و در دسترس برای اندازه گیری این رنگدانه هاست. در روش رایج، رنگدانه ها با حلال استخراج و جذب عصاره در طول موج های مشخص اندازه گیری می شود. روش های غیرمخرب مانند طیف سنجی بازتابی و NIR نیز امکان ارزیابی سریع تعداد زیادی نمونه را در مزرعه و برنامه های اصلاح نژاد فراهم می کنند.

برای آشنایی با اسپکتروفتومترهای بلورآزما، به بخش محصولات مراجعه کنید.

منابع

• Spectroscopic Determination of Leaf Chlorophyll Content and Color for Genetic Selection on Sassafras tzumu

• Quantitative Visualization of Photosynthetic Pigments in Tea Leaves Based on Raman Spectroscopy and Calibration Model Transfer

• Determination of Pigments in Virgin and Extra-Virgin Olive Oils

• Biological Activities of Plant Pigments Betalains

• https://doi.org/10.3390/molecules27165120