میکروسکوپ نوری چیست؟ اجزا، طرز کار و انواع میکروسکوپ نوری

میکروسکوپ نوری دستگاهی است که با استفاده از نور مرئی و مجموعه ای از عدسی ها، تصویر بزرگ شده ای از اجسام و موجودات بسیار ریز ایجاد می کند. میکروسکوپ نوری رایج ترین نوع میکروسکوپ در آزمایشگاه ها، مدارس، بیمارستان ها و مراکز تحقیقاتی است.

چون میکروسکوپ نوری در طول تاریخ بیشتر برای مشاهده میکروارگانیسم ها و سلول های گیاهی و جانوری استفاده شده، به آن میکروسکوپ زیستی نیز گفته می شود. امروزه میکروسکوپ های نوری در زیست شناسی، پزشکی، علم مواد، صنعت الکترونیک و پزشکی قانونی کاربرد گسترده ای دارند.

چشم انسان می تواند دو نقطه را تا فاصله حدود ۰.۱ میلی متر، تقریبا هم اندازه ضخامت یک تار مو، از هم تشخیص دهد. یک میکروسکوپ نوری خوب می تواند جزئیاتی تا حدود ۲۰۰ نانومتر را تفکیک کند؛ یعنی حدود ۵۰۰ برابر بهتر از چشم غیرمسلح.

تاریخچه میکروسکوپ نوری

• حدود سال ۱۶۰۰ میلادی: نخستین میکروسکوپ های مرکب با ترکیب دو عدسی در هلند ساخته شدند.

• سال ۱۶۶۵: رابرت هوک، دانشمند انگلیسی، با میکروسکوپ خود ساختار چوب پنبه را بررسی کرد و برای نخستین بار واژه سلول را به کار برد.

• اواخر قرن هفدهم: آنتونی فان لیوونهوک با میکروسکوپ های تک عدسی که خودش ساخته بود، برای نخستین بار باکتری ها و موجودات تک سلولی را مشاهده کرد.

• قرن بیستم: روش های جدیدی مانند میکروسکوپ فاز کنتراست، فلورسانس و کانفوکال توسعه یافتند. فریتس زرنیکه به خاطر اختراع میکروسکوپ فاز کنتراست در سال ۱۹۵۳ جایزه نوبل فیزیک را دریافت کرد.

اجزای میکروسکوپ نوری

آشنایی با بخش های مختلف میکروسکوپ نوری برای استفاده درست از آن و انتخاب میکروسکوپ مناسب اهمیت زیادی دارد.

عدسی چشمی

عدسی چشمی عدسی ای است که کاربر از آن به نمونه نگاه می کند. چشمی تصویر ایجاد شده توسط عدسی شیئی را دوباره بزرگ می کند. بزرگنمایی چشمی معمولا ۱۰ برابر است. میکروسکوپ ها ممکن است تک چشمی، دوچشمی یا سه چشمی (دارای خروجی برای دوربین) باشند.

عدسی شیئی

عدسی شیئی مهم ترین بخش میکروسکوپ است. این عدسی نزدیک نمونه قرار می گیرد، نور را از نمونه جمع آوری می کند و یک تصویر حقیقی و بزرگ شده ایجاد می کند. عدسی های شیئی معمولا بزرگنمایی های ۴، ۱۰، ۴۰ و ۱۰۰ برابر دارند و روی یک صفحه چرخان (روولور) نصب شده اند تا کاربر بتواند به راحتی بین آنها جابه جا شود.

کیفیت تصویر میکروسکوپ بیشتر به کیفیت عدسی شیئی و دهانه عددی (NA) آن بستگی دارد. عدسی شیئی ۱۰۰ برابر معمولا از نوع ایمرسیون روغنی است؛ یعنی یک قطره روغن ایمرسیون بین عدسی و نمونه قرار می گیرد تا نور کمتری هنگام عبور از شیشه به هوا شکسته و پراکنده شود و تفکیک تصویر افزایش یابد.

صفحه نمونه (استیج)

استیج صفحه تختی است که لام حاوی نمونه روی آن قرار می گیرد. استیج معمولا گیره هایی برای نگه داشتن لام دارد. در استیج مکانیکی، لام را می توان با پیچ هایی به طور دقیق در دو جهت جابه جا کرد.

منبع نور

منبع نور که معمولا یک لامپ هالوژن یا LED است، نور لازم برای مشاهده نمونه را تامین می کند. در میکروسکوپ های نور عبوری، منبع نور زیر استیج قرار دارد و نور از نمونه عبور می کند. در میکروسکوپ های نور بازتابی، نور از بالا به نمونه تابیده می شود و برای نمونه های مات مانند فلزات و بردهای الکترونیکی استفاده می شود.

کندانسور

کندانسور مجموعه ای از عدسی ها زیر استیج است که نور منبع را روی نمونه متمرکز می کند. کندانسور نقش مهمی در روشنایی یکنواخت، وضوح و تفکیک تصویر دارد.

دیافراگم ها

میکروسکوپ های نوری معمولا دو نوع دیافراگم دارند:

• دیافراگم کندانسور (دیافراگم دهانه): در کندانسور قرار دارد و زاویه مخروط نوری که به نمونه می رسد را تنظیم می کند. با بستن آن، کنتراست و عمق میدان افزایش می یابد، اما تفکیک کاهش پیدا می کند.

• دیافراگم میدان: نزدیک منبع نور قرار دارد و اندازه ناحیه روشن شده نمونه را محدود می کند تا نور اضافی و پراکنده کاهش یابد.

برخی میکروسکوپ ها فیلترهای رنگی یا فیلترهای کاهنده نور نیز دارند.

پیچ های تنظیم فوکوس

• پیچ درشت: برای جابه جایی سریع و تنظیم اولیه فوکوس، به ویژه با عدسی های کم بزرگنمایی

• پیچ ظریف: برای تنظیم دقیق فوکوس، به ویژه با عدسی های پربزرگنمایی

لوله، بازو و پایه

• لوله: چشمی را به عدسی شیئی متصل می کند و فاصله صحیح بین آنها را حفظ می کند.

• بازو: لوله را به پایه وصل می کند و هنگام جابه جایی میکروسکوپ، از آن برای نگه داشتن دستگاه استفاده می شود.

• پایه: بخش زیرین و سنگین میکروسکوپ که پایداری آن را تامین می کند و معمولا منبع نور در آن قرار دارد.

میکروسکوپ نوری چگونه کار می کند؟

1. آماده سازی نمونه: نمونه روی یک لام شیشه ای قرار گرفته و با یک لامل نازک پوشانده می شود. برای بسیاری از نمونه های زیستی، از رنگ آمیزی برای بهتر دیده شدن ساختارها استفاده می شود.

2. قرار دادن لام: لام روی استیج قرار گرفته و با گیره ها ثابت می شود.

3. روشنایی: نور منبع از کندانسور عبور کرده و روی نمونه متمرکز می شود.

4. بزرگنمایی اول: نور عبوری از نمونه وارد عدسی شیئی می شود که یک تصویر حقیقی بزرگ شده ایجاد می کند.

5. بزرگنمایی دوم: عدسی چشمی این تصویر را دوباره بزرگ می کند و کاربر یک تصویر مجازی بزرگ شده می بیند.

6. تنظیم فوکوس: کاربر با پیچ های درشت و ظریف، تصویر را واضح می کند.

برای آشنایی بیشتر با نحوه شکست نور در عدسی ها، مقاله شکست نور را بخوانید.

محاسبه بزرگنمایی میکروسکوپ

بزرگنمایی کل میکروسکوپ از حاصل ضرب بزرگنمایی عدسی شیئی و عدسی چشمی به دست می آید:

بزرگنمایی کل = بزرگنمایی شیئی × بزرگنمایی چشمی

حد تفکیک میکروسکوپ نوری

بزرگنمایی بیشتر به تنهایی جزئیات بیشتری نشان نمی دهد. آنچه اهمیت دارد حد تفکیک است؛ یعنی کمترین فاصله بین دو نقطه که هنوز جدا از هم دیده شوند. به دلیل پراش نور، حد تفکیک میکروسکوپ نوری محدود است و از این رابطه به دست می آید:

d = λ / (2 × NA)

که در آن λ طول موج نور و NA دهانه عددی عدسی شیئی است. با نور مرئی و بهترین عدسی ها، حد تفکیک حدود ۲۰۰ نانومتر است. به همین دلیل بزرگنمایی مفید میکروسکوپ نوری حداکثر حدود ۱۰۰۰ تا ۱۵۰۰ برابر است و بزرگنمایی بیشتر فقط تصویر را بزرگ تر و تارتر می کند. برای دیدن جزئیات کوچک تر، مانند ویروس ها، از میکروسکوپ الکترونی استفاده می شود.

انواع میکروسکوپ نوری

میکروسکوپ مرکب (زمینه روشن)

میکروسکوپ مرکب رایج ترین نوع میکروسکوپ نوری در آموزش، آزمایشگاه های تشخیص طبی و تحقیقات است. این میکروسکوپ از ترکیب عدسی شیئی و چشمی برای بزرگنمایی استفاده می کند و چند عدسی شیئی با بزرگنمایی های مختلف دارد. در حالت معمول، نمونه روی زمینه ای روشن تیره تر دیده می شود که به آن زمینه روشن می گویند.

میکروسکوپ زمینه تاریک

در میکروسکوپ زمینه تاریک، نور مستقیم منبع به عدسی شیئی نمی رسد و فقط نوری که توسط نمونه پراکنده شده دیده می شود. در نتیجه نمونه به صورت روشن روی زمینه تاریک دیده می شود. این روش برای مشاهده باکتری های زنده و ذرات بسیار ریز مناسب است.

میکروسکوپ استریو

میکروسکوپ استریو یا میکروسکوپ تشریح، تصویری سه بعدی از نمونه ارائه می دهد. این میکروسکوپ دو مسیر نوری جداگانه برای دو چشم دارد که هر کدام نمونه را از زاویه کمی متفاوت می بینند و درک عمق ایجاد می شود.

میکروسکوپ استریو معمولا با نور بازتابی کار می کند و برای نمونه های بزرگ تر و مات مناسب است. بزرگنمایی آن کمتر از میکروسکوپ مرکب و معمولا تا حدود ۵۰ برابر است، اما میدان دید وسیع و فاصله کاری زیاد دارد که امکان کار با ابزار زیر میکروسکوپ را فراهم می کند. کاربردهای آن شامل تشریح، ساعت سازی، بازرسی و تعمیر برد مدار چاپی، جواهرسازی و بررسی حشرات و گیاهان است.

میکروسکوپ فاز کنتراست

بسیاری از نمونه های زیستی زنده، مانند سلول ها و میکروارگانیسم ها، شفاف و بی رنگ هستند و در میکروسکوپ معمولی به سختی دیده می شوند. رنگ آمیزی این نمونه ها معمولا باعث مرگ سلول ها می شود.

میکروسکوپ فاز کنتراست این مشکل را حل می کند. نوری که از بخش های مختلف یک نمونه شفاف عبور می کند، به دلیل تفاوت ضریب شکست، اختلاف فاز کوچکی پیدا می کند که چشم قادر به دیدن آن نیست. میکروسکوپ فاز کنتراست این اختلاف فاز را به اختلاف روشنایی تبدیل می کند.

اجزای اصلی میکروسکوپ فاز کنتراست عبارت اند از:

• دیافراگم حلقوی در کندانسور که نور را به صورت یک مخروط توخالی به نمونه می تاباند.

• حلقه فاز در عدسی شیئی که فاز نور مستقیم (پراکنده نشده) را تغییر داده و شدت آن را کاهش می دهد.

در نتیجه، نور مستقیم و نوری که توسط نمونه پراکنده شده با هم تداخل می کنند و ساختارهای داخلی سلول، مانند هسته و اندامک ها، با کنتراست بالا دیده می شوند. برای این کار، حلقه دیافراگم کندانسور باید با حلقه فاز عدسی شیئی تراز شود. این روش امکان مشاهده سلول های زنده را بدون رنگ آمیزی فراهم می کند.

میکروسکوپ فلورسانس

میکروسکوپ فلورسانس از مولکول هایی به نام فلوئوروفور استفاده می کند که نور را در یک طول موج جذب کرده و در طول موج بلندتری گسیل می کنند. این فلوئوروفورها به مولکول ها یا ساختارهای مشخصی در سلول یا بافت متصل می شوند و فقط همان ساختارها را نورانی می کنند. یکی از مشهورترین فلوئوروفورها، پروتئین فلورسنت سبز (GFP) است که کشف و توسعه آن در سال ۲۰۰۸ جایزه نوبل شیمی را به همراه داشت.

یک میکروسکوپ فلورسانس معمولا یک مکعب فیلتر با سه جزء دارد:

1. فیلتر تحریک: فقط طول موجی از نور منبع را که فلوئوروفور جذب می کند عبور می دهد.

2. آینه دیکروئیک: نور تحریک را به سمت نمونه بازتاب می دهد و نور گسیل شده از نمونه را که طول موج بلندتری دارد، به سمت چشمی یا دوربین عبور می دهد.

3. فیلتر گسیل: فقط نور گسیل شده از فلوئوروفور را عبور می دهد و نور تحریک باقی مانده را مسدود می کند.

به این ترتیب، ساختارهای نشان دار شده به صورت نورانی روی زمینه تاریک با کنتراست بسیار بالا دیده می شوند. برای آشنایی با آینه های دیکروئیک، مقاله [آینه اپتیکی] را بخوانید.

میکروسکوپ کانفوکال

میکروسکوپ کانفوکال یا هم کانونی نوعی میکروسکوپ فلورسانس پیشرفته است که نمونه را با یک پرتو لیزر متمرکز، نقطه به نقطه اسکن می کند. ویژگی اصلی آن یک روزنه بسیار کوچک (پین هول) در جلوی آشکارساز است که نور خارج از فوکوس را حذف می کند.

در نتیجه، میکروسکوپ کانفوکال برش های نوری بسیار واضح از عمق های مختلف نمونه تهیه می کند و با ترکیب این برش ها، تصویر سه بعدی نمونه ساخته می شود. این میکروسکوپ در زیست شناسی سلولی، علوم اعصاب و علم مواد کاربرد گسترده ای دارد.

میکروسکوپ پلاریزان

میکروسکوپ پلاریزان از نور قطبیده استفاده می کند و دو قطبشگر دارد؛ یکی پیش از نمونه و دیگری پس از آن. موادی که دوشکستی هستند، مانند بسیاری از کانی ها، بلورها، الیاف و پلیمرها، قطبش نور را تغییر می دهند و با رنگ ها و الگوهای مشخصی دیده می شوند. این میکروسکوپ در زمین شناسی (سنگ شناسی)، شناسایی کانی ها، علم مواد و پزشکی قانونی استفاده می شود. برای آشنایی با قطبش نور، مقاله پلاریمتر را بخوانید.

میکروسکوپ دیجیتال

میکروسکوپ دیجیتال به جای چشمی یا علاوه بر آن، یک دوربین دیجیتال دارد که تصویر نمونه را روی صفحه نمایش یا رایانه نشان می دهد. این دوربین ها معمولا از سنسورهای CMOS یا CCD استفاده می کنند. میکروسکوپ های دیجیتال امکان ثبت عکس و فیلم، اندازه گیری ابعاد، اشتراک گذاری تصاویر و آنالیز تصویر با نرم افزار را فراهم می کنند.

مقایسه میکروسکوپ نوری و میکروسکوپ الکترونی

نکات استفاده و نگهداری از میکروسکوپ نوری

• همیشه بررسی نمونه را با کمترین بزرگنمایی شروع کنید و سپس به تدریج بزرگنمایی را افزایش دهید.

• با عدسی های پربزرگنمایی، فقط از پیچ ظریف استفاده کنید تا عدسی به لام برخورد نکند.

• عدسی ها را فقط با کاغذ مخصوص لنز تمیز کنید.

• پس از استفاده از عدسی روغنی، روغن را از عدسی و لام پاک کنید.

• هنگام جابه جایی، میکروسکوپ را با یک دست از بازو و با دست دیگر از پایه نگه دارید.

• پس از استفاده، کاور میکروسکوپ را بکشید تا از گرد و غبار محافظت شود.

کاربردهای میکروسکوپ نوری

• زیست شناسی و میکروبیولوژی: مشاهده سلول ها، باکتری ها و میکروارگانیسم ها

• پزشکی و آسیب شناسی: بررسی نمونه های بافت و خون برای تشخیص بیماری ها

• علم مواد و متالورژی: بررسی ساختار فلزات و مواد

• صنعت الکترونیک: بازرسی بردهای مدار و تراشه ها

• زمین شناسی: شناسایی کانی ها و سنگ ها

• پزشکی قانونی: بررسی الیاف، مو و شواهد

• صنایع دارویی و غذایی: کنترل کیفیت و بررسی ذرات

سوالات متداول درباره میکروسکوپ نوری

میکروسکوپ نوری چیست؟

دستگاهی که با نور مرئی و عدسی ها، تصویر بزرگ شده ای از اجسام و موجودات بسیار ریز ایجاد می کند.

بزرگنمایی میکروسکوپ نوری چگونه محاسبه می شود؟

از حاصل ضرب بزرگنمایی عدسی شیئی در بزرگنمایی عدسی چشمی؛ برای مثال، شیئی ۴۰ برابر و چشمی ۱۰ برابر، بزرگنمایی کل ۴۰۰ برابر ایجاد می کنند.

حداکثر بزرگنمایی میکروسکوپ نوری چقدر است؟

بزرگنمایی مفید آن حدود ۱۰۰۰ تا ۱۵۰۰ برابر است، چون حد تفکیک آن به دلیل پراش نور حدود ۲۰۰ نانومتر محدود است.

چرا در عدسی ۱۰۰ برابر از روغن استفاده می شود؟

برای جلوگیری از شکست و پراکندگی نور هنگام عبور از لام به هوا و افزایش دهانه عددی و تفکیک تصویر.

تفاوت میکروسکوپ مرکب و استریو چیست؟

میکروسکوپ مرکب بزرگنمایی بیشتری دارد و برای نمونه های نازک و شفاف استفاده می شود، اما میکروسکوپ استریو تصویر سه بعدی، میدان دید وسیع و فاصله کاری بیشتری برای نمونه های بزرگ تر دارد.

جمع بندی

میکروسکوپ نوری با استفاده از نور مرئی و ترکیب عدسی های شیئی و چشمی، تصویر بزرگ شده ای از نمونه های ریز ایجاد می کند. اجزای اصلی آن شامل عدسی چشمی، عدسی شیئی، استیج، منبع نور، کندانسور، دیافراگم ها و پیچ های فوکوس است. حد تفکیک میکروسکوپ نوری به دلیل پراش نور حدود ۲۰۰ نانومتر است. انواع مختلف میکروسکوپ نوری، از جمله مرکب، زمینه تاریک، استریو، فاز کنتراست، فلورسانس، کانفوکال، پلاریزان و دیجیتال، هر کدام برای کاربردهای خاصی در زیست شناسی، پزشکی، علم مواد، صنعت و زمین شناسی طراحی شده اند.

منابع

• Introduction to Optical Microscopy