آنچه در این مقاله میخوانید
طیف سنجی فلورسانس یک روش تحقیقاتی بر اساس ویژگی های فلورسانسی ماده نمونه مورد مطالعه است و برای اندازه گیری کمی محصولات شیمیایی استفاده می شود.
طیف سنجی فلورسانس یک مولکول را بر اساس خواص فلورسنت آن تجزیه و تحلیل می کند که نوعی خاصیت نورتابی است که در ترکیبات شیمیایی مختلفی اتفاق می افتد.
طیف سنجی فلورسانس بر مبنای جذب امواج الکترومغناطیسی (تابش نور یا حرارت) توسط مولکول ها در حالت پایه انرژی و رسیدن آنها به حالت برانگیخته به وجود می آید.
در حقیقت، از پرتوی نور استفاده می شود که الکترون های موجود در مولکول های ترکیبات خاص را تحریک کند و باعث شود آنها نور ساطع کنند.
یك ماده فلورسانس، انرژی دریافتی را در خود ذخیره می كند و در نهایت آن انرژی را به شکل طیفی از امواج مرئی منتشر می كند که این پدیده سریع است و بلافاصله پس از جذب نور، آغاز و با قطع تابش ورودی، سریعاً خاموش می شود.
در آخر، نور ساطع شده به سمت یک فیلتر و به یک آشکارساز برای اندازه گیری و شناسایی مولکول یا تغییرات در مولکول هدایت می شود.
اصطلاح فلورسانس به پدیده کلی لومینسانس اشاره دارد که انتشار نور از یک مولکول است و انواع مختلفی دارد.
در دمای اتاق، بیشتر مولکول ها پایین ترین سطح ارتعاشی (حالت الکترونی پایه) را اشغال می کنند و با جذب نور به سطوح انرژی بالا می روند تا حالت های برانگیخته ایجاد کنند.
پس از آنکه الکترون با جذب فوتون پرانرژی (نور با طول موج کوتاه) از تراز پایه به تراز برانگیخته می رود، در وضعیت نامتعادلی قرار می گیرد و تمایل دارد که انرژی خود را از دست بدهد و به تراز پایه برگردد.
در طیف سنجی فلورسانس، ممکن است که الکترون مستقیماً به تراز پایه برنگردد. بلکه ابتدا به ترازهای برانگیخته پایین تر رفته و سپس به تراز پایه اصلی برسد که در این حالت الکترون، فوتون هایی با انرژی کمتر (یعنی طول موج بلندتر) از خود ساطع می کند.
یعنی نور با طول موج معینی را جذب نموده، اما نور با طول موج متفاوتی را گسیل می کند که این پدیده به جا به جایی استوکس موسوم است.
طیف فلورسانس حالت پایدار زمانی اتفاق می افتد که مولکول هایی که توسط منبع ثابت نور برانگیخته می شوند، نور فلورسنت ساطع می کنند و شدت فوتون های ساطع شده، تابعی از طول موج تشخیص داده می شوند.
طیف انتشار فلورسانس حاصل زمانی است که طول موج تحریک ثابت است و طول موج انتشار اسکن می شود تا نمودار شدت بر حسب برابر طول موج انتشار به دست آید.
به این ترتیب، طیف اطلاعاتی در مورد طول موج هایی که یک نمونه جذب می کند، ارائه می دهد که مشابه با طیف جذب در اسپکتروفتومتر است، اما از نظر محدودیت های تشخیص و ویژگی مولکولی، تکنیک بسیار حساس تری است.
به علاوه، طیف های فلورسانس، مختص یک طول موج/نوع ساطع کننده منفرد هستند، برخلاف طیف جذب اسپکتروفتومتر، که همه گونه های جذب کننده را در یک محلول یا نمونه اندازه گیری می کند.
در طیف سنجی فلورسانس برای بسیاری از مواد، طیف جذب و فلورسانس، تصویر آینه ای یکدیگر هستند که این مورد با عنوان تصویر آینه ای شناخته می شود و مرتبط با اصل فرَنک-کاندون است.
هر دو طیف (جذب و فلورسانس) برای مشاهده چگونگی تغییر یک نمونه استفاده می شود. شدت طیفی و یا قله طیف ممکن است در اثر پارامترهای مختلفی مانند دما، غلظت یا برهمکنش با سایر مولکول های اطراف آن تغییر کند.
مولکول ها و مواد فلورسنت در اشکال و اندازه های مختلف وجود دارند که برخی از آنها ذاتاً فلورسنت هستند، مانند کلروفیل و باقی مانده اسید آمینه تریپتوفان (Trp)، فنیل آلانین (Phe) و تیروزین (Tyr).
برخی دیگر مولکول هایی هستند که به طور خاص به عنوان رنگ های آلی پایدار یا برچسب هایی سنتز شده اند تا به سیستم های غیر فلورسنت اضافه شوند.
به طور معمول، مولکول های فلورسنت آلی دارای حلقه های آروماتیک و الکترون های مزدوج Pi هستند و بسته به اندازه و ساختار آنها، می توانند از محدوده فرابنفش تا فروسرخ طیف تابش داشته باشند.
چند دسته از مولکول ها و مواد فلورسنت عبارت اند از:
اصل فرنک کاندون بیان میکند که گذار الکترونی به صورت عمودی است و این تغییرات انرژی بدون تغییر مکان صورت می گیرند که می توان آنها را به صورت خطی عمودی در دیاگرام جابلونسکی نشان داد.
این امر بدان معنی است که هسته، حرکتی ندارد و سطوح ارتعاشی حالت برانگیخته، مشابه سطوح ارتعاشی حالت پایه هستند.
نمودار ساده شده زیر، جذب مولکول ها را برای ایجاد حالت برانگیخته اول S1، یا دوم S2 نشان می دهد. جذب امواج الکترومغناطیسی (نور) توسط جمعیتی از مولکول ها، باعث گذار الکترون ها از سطح پایه S0 به یک حالت برانگیخته Sn ((n>l می شود (نه حالت پایه قبل).
با جذب انرژی و رسیدن به یکی از سطوح بالاتر ارتعاشی حالت برانگیخته، مولکول به سرعت انرژی ارتعاشی اضافی خود را در اثر برخورد از دست می دهد و به پایین ترین سطح ارتعاشی حالت برانگیخته سقوط می کند.
به طور کلی در طیف سنجی فلورسانس، یک مولکول برانگیخته پس از دو مرحله متوالی به حالت پایه S0 باز می گردد:
1- مولکول در حالت Sn با اتلاف بخشی از انرژی خود در محیط اطراف، به پایین ترین حالت تک گانه S1 باز می گردد و این پدیده معمولاً تبدیل داخلی نامیده می شود.
2- از حالت برانگیخته S1، مولکول از طریق فرآیندهای رقابتی مختلفی به حالت پایه S0 می رسد که شامل موارد زیر می شود:
معمولاً موارد توضیح داده شده در بخش قبل، با استفاده از نمودار جابلونسکی نمایش داده می شود، که نمودار گذارهای الکترونی نیز نامیده می شود (شکل زیر).
طیف گسترده ای از مواد به عنوان خاموش کننده فرایند فلورسانس عمل می کنند. برای مثال خاموش شدن خاصیت فلورسنت توسط اکسیژن، به دلیل ماهیت پارامغناطیس آن است که باعث می شود انرژی تحت عبور بین سیستمی، به حالت سه گانه برسد.
علاوه بر این، تقریباً تمام مولکول هایی که حالت الکترونی بالاتر از حالت دوم را اشغال می کنند، تحت تبدیل داخلی قرار می گیرند و از پایینترین سطح ارتعاشی حالت فوقانی به بالاترین سطح ارتعاشی از بین حالات برانگیخته پایین تر که انرژی یکسانی دارد، عبور می کنند.
از آنجا، مولکول ها دوباره انرژی خود را از دست می دهند تا زمانی که به پایین ترین سطح ارتعاشی اولین حالت برانگیختگی برسند که از این سطح، مولکول می تواند به هر یک از سطوح ارتعاشی حالت پایه بازگردد و انرژی خود را به شکل فلورسانس ساطع کند.
اگر این فرآیند برای همه مولکول هایی که نور را جذب کرده اند انجام شود، بازده کوانتومی ماده حداکثر خواهد بود و اگر مسیر دیگری دنبال شود، بازده کوانتومی کمتر از یک و حتی ممکن است تقریباً صفر باشد.
گذار 0→0، که از پایین ترین سطح ارتعاشی حالت الکترونی پایه به پایینترین سطح ارتعاشی در اولین حالت برانگیخته، در هر دو پدیده جذب و انتشار مشترک است، در حالی که گذارهای جذب دیگر به انرژی بیشتری نیاز دارند.
بنابراین می توان انتظار داشت که طیف گسیلی در طول موج مربوط به گذار 0→0 با طیف جذبی همپوشانی داشته باشد و بقیه طیف گسیلی انرژی کمتر یا طول موج بلندتری داشته باشد (شکل زیر).
در عمل، به ندرت گذار 0→0 در طیف جذب و انتشار دقیقاً بر هم منطبق هستند و این عدم انطباق، نشان دهنده اتلاف اندک انرژی از طریق برهمکنش مولکول جاذب نور با مولکول های حلال اطراف است.
برانگیختگی می تواند منجر به رسیدن مولکول به هر یک از سطوح فرعی ارتعاشی مرتبط با هر حالت الکترونی شود و از آنجایی که انرژی به صورت کوانتومی مجزا جذب می شود، حاصل این امر باید یک سری نوارهای جذب مجزا باشد.
با این حال، سطوح دورانی مرتبط با هر سطح ارتعاشی را نیز نمی توان نادیده گرفت و معمولاً تعداد نوارهای جذبی ممکن را به حدی افزایش میدهد که شناخت گذارها غیرممکن میشود.
بنابراین، اکثر ترکیبات طیف جذب گسترده ای دارند (به جز آنهایی که سطوح چرخشی محدودی دارند، مانند ترکیبات مسطح).
اصطلاحات حالت های تک گانه و سه گانه در طیف سنجی فلورسانس، حاصل عدد کوانتومی اسپین s هستند که چرخش الکترون حول محور خود، یک آهنربای کوچک موضعی با اسپین s تولید می کند. حالت های تک گانه و سه گانه به تعداد کوانتومی اسپین الکترون (ها) بستگی دارد.
انرژی فلورسانس بیشتر از انرژی فسفرسانس است زیرا جذب و نشر فلورسانسی نیازی به جهت گیری مجدد اسپین ندارد و بنابراین، فرآیندهای جذب و فلورسانس بسیار سریع تر خواهد بود.
فرایند فسفرسانس یک گذار طولانی است، در برخی موارد می تواند از میلی ثانیه تا ثانیه، دقیقه یا حتی ساعت نیز طول بکشد.
در طیف سنجی فلورسانس، انرژی انتقال الکترونی همانند دیگر فرایندهای مبتنی بر فیزیک کوانتوم، برابر با اختلاف انرژی بین سطح انرژی اولیه و سطح نهایی است.
E = h ν = h c/λ
که در آن h ثابت پلانک است (h = 6.63×10-34 J · s)، ν فرکانس نور (s-1 یا Hz)، c سرعت نور، و λ طول موج (nm) است. بنابراین، هر گذار با یک انرژی خاص و بنابراین در یک طول موج منحصر به فردی رخ می دهد.
طیف های حاصل از طیف سنجی فلورسانس، بیشترین تطابق با گذار انتشاری را نشان می دهند. این طیف ها، و نه خطوط، به عنوان نتایج مشارکت سطوح چرخشی و ارتعاشی در انرژی جذب و انتشار مشاهده می شوند.
جذب انرژی برای تولید اولین حالت برانگیخته شکل سیستم (مولکول یا اتم) را چندان مختل نمی کند و این بدان معنی است که توزیع سطوح ارتعاشی در هر دو حالت پایه و برانگیخته اول، بسیار نزدیک است.
از آنجایی که انتشار فلورسانس همیشه از پایین ترین سطح ارتعاشی اولین حالت برانگیخته صورت می گیرد، با وجود تغییر طول موج نور برانگیخته، شکل طیف انتشار همیشه یکسان است و انتشار از جمعیت مولکول های برانگیخته (n) با شدت I رخ می دهد:
I = n E
همانند دیگر تکنیک های طیف سنجی نوری، تمامی دستگاه های طیف سنجی فلورسانس نیز از چند جزء اصلی تشکیل می شوند:
از یک منبع نور برای تحریک نمونه استفاده می شود که رایج ترین منابع نور مورد استفاده در طیف سنجی فلورسانس لامپ های جیوه ای، لامپ های زنون و لیزر هستند.
نگهدارنده نمونه برای نگه داشتن نمونه در جای خود در طول آزمایش استفاده می شود و جوری طراحی شده است تا میزان نور سرگردانی را که وارد آشکارساز می شود، در حداقل میزان ممکن باشد.
در عمل، برای تحقق بیشترین بازده دستگاه های طیف سنجی فلورسانس، تنها طیف کوچکی از طول موج های ساطع شده از مواد بررسی می شود و شدت نور فرودی بیش از حد لزوم نمی شود.
برای انتخاب طول موج خاصی از نور از منبع نور، معمولاً از یک مونوکروماتور یا تک رنگ ساز استفاده می شود که طول موج های ناخواسته نور منبع را فیلتر کرده و به مابقی طیف اجازه تابش به ماده را می دهد.
در بخش گزینش مونوکروماتور، از توری های پراش و شکاف ها برای انتخاب نور در یک طول موج خاص و حذف بقیه طیف استفاده می شوذ.
توری پراش نور را به اجزای طیفی بسیار ریزی تبدیل می کند تا گزنیش دقیق تری اتفاق بیفتد و شکاف ها، عرض بازه طول موجی را کنترل می کنند.
بیشترین حساسیت را می توان با استفاده از فیلترهایی به دست آورد که اجازه می دهند طیف وسیعی از طول موج های ساطع شده از نمونه جمع آوری شود (البته به شرط استفاده از منبعی با بالاترین شدت ممکن).
در برخی از دستگاه های طیف سنجی فلورسانس، از دو مونوکروماتور، یکی برای تابش منبع و دیگری برای نور برانگیخته استفاده می شود که دقت بالاتری ارائه می دهند.
دستگاه های طیف سنجی فلورسانس ساده دارای ابزاری برای آنالیز توزیع طیف گسیل شده از نمونه هستند که آشکارساز گفته می شوند.
آشکارسازها قادر به تشخیص تک فوتون ها هستند، بنابراین مهم است که هر نور ناخواسته به طور موثر توسط تک رنگ ساز حذف یا فیلتر شود، تا از هرگونه پس زمینه در طیف گسیلی جلوگیری شود.
به طور کلی طیف سنجی فلورسانس در دو دسته جای می گیرد:
در روش طیف سنجی فلورسانس اتمی، نشر نور از اتم های برانگیخته صورت می گیرد و در حالی که در روش دوم، مولکول های برانگیخته هستند که عمل جذب و نشر را انجام می دهند.
در طیف سنجی فلورسانس نوع اتمی، نمونه با استفاده از یونیزاسیون (مانند قرار گرفتن در معرض شعله یا سایر منابع گرما)، به اتم های گازی تبدیل می شود.
سپس گاز اتمی تشکیل شده در معرض نور مرئی یا فرابنفش با طول موج مشخصی قرار می گیرد. این نور با اتم های یک عنصر خاص برهمکنش می کند و عنصر مورد نظر، سطح انرژی الکترونی بالاتری برانگیخته شده و تابش فلورسانس اتفاق می افتد.
سپس نور فلورسنت توسط یک آشکارساز دریافت می شود که به نوبه خود می تواند غلظت آن عنصر خاص را محاسبه کند. با تکرار این فرآیند و آزمایش برای عناصر مختلف، می توان آرایش عنصری نمونه را تعیین کرد.
این تکنیک، بیشتر برای اندازه گیری سطوح فلزات سنگین سمی در مواد غذایی، آب و نمونه های زیست محیطی استفاده می شود.
البته کاربردهای طیف سنجی فلورسانس به آزمایش های زیست پزشکی نیز گسترش می یابد، جایی که این روش می تواند برای آزمایش فلزات در نمونه های خون و ادرار استفاده شود.
در حوزه معدن و متالورژی نیز برای تعیین غلظت فلز در نمونه های سنگ معدن استفاده می شود که به ارزیابی کیفیت سنگ معدن پیش از استخراج کمک می کند.
دستگاه های طیف سنجی به روش فلورسانس اتمی انواع مختلفی دارند که عبارت اند از:
در حال حاضر طیف سنجی فلورسانس نوع رزونانسی به دلیل کمترین میزان تداخل و همچنین ایجاد برانگیختگی انتخابی در الکترون ها که بیشترین کاربرد را دارد. در این نوع تکنیک، که ساده ترین نوع می باشد، الکترون بعد از نشر نور، به همان تراز اولیه خود بر می گردد.
از آنجا که سطوح پایه و برانگیخته یکسان هستند، بنابراین طول موج فوتون های جذبی و نشری با یکدیگر برابر خواهند بود. بنابراین هیچگونه انتقال انرژی درونی (مثل اتلاف انرژی از طریق گرما و یا برخورد) اتفاق نمی افتد.
در حالی که در انواع دیگر فلورسانس اتمی، پیش از بازگشت الکترون از حالت برانگیخته به حالت پایه، درون اتم انتقالات انرژی نیز صورت می گیرد.
فلورسانس مولکولی انتشار نور از مولکول هایی است که با جذب تابش الکترومغناطیسی به سطوح انرژی بالاتر برانگیخته شده اند. مزیت اصلی تشخیص فلورسانس در مقایسه با اندازه گیری جذب، حساسیت بیشتر قابل دستیابی است زیرا سیگنال فلورسانس در اصل دارای پس زمینه صفر است.
یکی از کاربردهای تحلیلی این تکنیک، شامل اندازه گیری کمی مولکول ها در محلول و تشخیص فلورسانس در کروماتوگرافی مایع است.
معمولاً در طرح یک طیف سنج فلورسانس مولکولی، یک منبع تحریک (لامپ یا لیزر)، یک تک رنگ ساز یا یک فیلتر (در صورت استفاده از لامپ به عنوان منبع برانگیختگی)، یک نگهدارنده که بتوانیم نمونه را درون آن قرار دهیم (کووت یا سل)، یک آشکارساز فوتونی و یک ضبط کننده به کار می روند.
در این مقاله، به طور مفصل در مورد تکنیک طیف سنجی فلورسانس صحبت شد. مکانیزم عملکردی، اصول بنیادین آن بر پایه فیزیک کوانتوم و انواع آن شرح داده شد. امیدواریم که مفید باشد.
در آخر به شما کاربر عزیز پیشنهاد می کنیم که بخش محصولات شرکت دانش بنیان بلورآزما را نیز مشاهده کنید و در صورت نیاز کاتالوگ هر محصول را به صورت جداگانه دانلود کرده و حتی برای دوستان خود بفرستید.
Priciple s of Fluorescence Spectroscopy
Molecular Fluorescence: Principles and Applications
An Introduction to Fluorescence Spectroscopy, 2000, PerkinElmer, Inc.
R. Koirtyohann, A history of atomic absorption spectroscopy, Spectrochemical Acta Part B: Atomic Spectroscopy, Volume 35, Issues 11–12, 1980, Pages 663-670, ISSN 0584-8547.
مقالات منتشر شده در ساعاتی قبل