آنچه در این مقاله می‌خوانید
برخی از مواد شیمیایی مخلوط های پیچیده ای هستند و آزمایش های جداسازی اجزای آنها اغلب یک یا چند مرحله جداسازی پی در پی را می طلبد تا اجزای مورد نظر جدا یا تغلیظ شوند. یکی از این روش های معمول برای دست یافتن به این جداسازی، تکنیک کروماتوگرافی است.
کروماتوگرافی یک روش آزمایشگاهی است که برای جداسازی و تجزیه و تحلیل اجزای یک مخلوط در حالت گاز یا مایع استفاده می شود بنابراین می توان اجزای جزئی را به طور کامل تفیکیک کرد.
انواع مختلفی از تکنیک های کروماتوگرافی وجود دارد که شامل کروماتوگرافی گازی (GC)، مایع (LC)، لایه نازک (TLC) و سایر روش های مربوطه می‌شود و هر نوع، کاربرد و روش خاص خود را دارد.
این تکنیک آزمایشگاهی، به طور گسترده در حوزه هایی مانند داروسازی، پزشکی قانونی، تجزیه و تحلیل محیطی و تحقیقات بیوشیمیایی برای شناسایی، خالص سازی و تعیین کمیت مواد مختلف در یک مخلوط استفاده می شود.
در این مقاله ابتدا تعریف دقیقی از تکنیک کلی کروماتوگرافی ارائه می دهیم، اجزای کلیدی دستگاه را بررسی کرده و در نهایت به انواع تکنیک های رایج آن می پردازیم. با ما همراه باشید.
تکنیک کروماتوگرافی بر این اصل استوار است که اجزای مختلف یک مخلوط، میل ترکیبی و رفتار متفاوتی در فاز ثابت و فاز متحرک دارند.
در حقیقت، این روش شامل جداسازی اجزای یک مخلوط بر اساس توزیع دیفرانسیل (differential distribution)، فاز ساکن (stationary phase) و میان فاز متحرک (mobile phase) است.
مخلوط ابتدا بر روی یک فاز ثابت اعمال می شود که می تواند یک ماده جامد یا یک پوشش مایع روی یک تکیه گاه جامد باشد.
فاز متحرک که معمولاً مایع یا گاز است، از فاز ساکن عبور می کند. همانطور که فاز متحرک در فاز ساکن حرکت می کند، اجزای مخلوط بر اساس تمایلات مختلف خود از هم جدا می شوند.
در ادامه یک نمای کلی از نحوه عملکرد کروماتوگرافی آورده شده است. توجه داشته باشید که بسته به نوع تکنیک مورد استفاده، مکانیزم می تواند متفاوت باشد و هر تکنیک اصول و تغییرات خاص خود را از نظر فاز ثابت، فاز متحرک و روش های تشخیص دارد.
کروماتوگرافی
فاز ساکن ماده ای با خواص شیمیایی خاص است که برای دستیابی به جداسازی استفاده می شود که می تواند یک جامد (به عنوان مثال، یک برد جامد پوشش داده شده با یک مایع) یا یک مایع (مانند یک بستر قالب گیری شده یا ژل) باشد.
فاز متحرک که به عنوان شوینده نیز شناخته می شود، مایع یا گازی است که مخلوط نمونه را از فاز ساکن عبور می دهد. در حقیقت، فاز متحرک با هر کدام از اجزای مخلوط برهمکنش متفاوتی دارد و بنابراین، منجر به جدا شدن آنها می شود.
یک دستگاه کروماتوگراف، بسته به اینکه نوع برهمکنش فاز متحرک و ماده چه مکانیزمی دارد، طراحی می شود. مکانیزم های رایج شامل موارد زیر می باشند:
لازم به ذکر است که بیشتر کاربردهای تحلیلی با استفاده از روش جداسازی کروماتوگرافی، بر پایه مکانیزم های تعویض یون و توزیع صورت می گیرند. در بخش های بعدی به این مهم خواهیم پرداخت.
همانطور که مخلوط نمونه در فاز ساکن حرکت می کند، برخی از اجزا برهمکنش قوی تری دارند و مدت زمان بیشتری (زمان نگهداشت یا زمان ماند) را در فاز ساکن می گذرانند، در حالی که برخی دیگر با سرعت بیشتری در ستون حرکت می کنند.
شویش، به فرآیند جدا سازی یا شسته شدن اجزا از فاز ساکن اشاره دارد که با تنظیم ترکیب فاز متحرک یا تغییر نرخ جریان آن به دست می آید.
پس از جداسازی، اجزای جداگانه بسته به ماهیتشان، به طور معمول با استفاده از تکنیک های مختلف شناسایی و تجزیه و تحلیل می شوند. رایج ترین این تکنیکی ها شامل اسپکتروفتومتری، طیف سنجی جرمی یا سایر روش های تشخیصی خاص است.
به طور کلی، دو شکل پایه ای کروماتوگرافی، صفحه ای و ستونی هستند که به طور گسترده برای جداسازی های تحلیلی و آماده سازی در زمینه های مختلف علمی مانند شیمی، بیوشیمی، داروسازی و تجزیه و تحلیل محیطی استفاده می شوند.
در شکل صفحه ای، فاز ساکن یک لایه نازک از مواد جاذب (مانند سیلیکاژل یا سلولز) است که بر روی یک تکیه گاه صاف (معمولاً یک صفحه شیشه ای یا پلاستیکی) پوشانده شده است و فاز متحرک، معمولاً یک حلال یا مخلوطی از حلال ها، با عمل مویرگی در فاز ساکن حرکت می کند.
در حقیقت، مخلوط نمونه به صورت یک نقطه یا خط کوچک در نزدیکی یک انتهای صفحه اعمال می شود و اجازه می دهد تا با فاز متحرک مهاجرت کند.
همانطور که فاز متحرک در فاز ساکن حرکت می کند، اجزای مخلوط نمونه به طور متفاوتی با فاز ساکن برهمکنش می کنند که منجر به جدایی آنها می شود.
مکانیزم کروماتوگرافی صفحه ای
پس از تکمیل این مرحله، صفحه خشک می شود و اجزای جدا شده را می توان با استفاده از تکنیک های مختلف مانند نور UV، رنگ آمیزی یا اسپری کردن ریجنت خاص مشاهده کرد.
مسافت طی شده توسط هر جزء (اندازه گیری شده از نقطه کاربرد) به عنوان مقدار Rf (ضریب تأخیر) شناخته می شود که می تواند برای اهداف شناسایی و مقایسه استفاده شود.
در نوع ستونی، فاز ساکن در یک ستون استوانه ای (شیشه یا فلز) بسته بندی می شود که به طور معمول یک ماده جامد (مانند سیلیکاژل یا دانه های رزین) یا یک جاذب مایع است.
فاز متحرک (حلال یا مخلوطی از حلال های خاص) به طور مداوم با استفاده از گرانش یا اختلاف فشار از ستون عبور می کند.
مخلوط نمونه در بالای ستون بارگذاری می شود و با عبور فاز متحرک از ستون، اجزاء با فاز ساکن تعامل دارند. جداسازی زمانی اتفاق می‌افتد که اجزای متفاوت، با سرعت های متفاوتی در ستون حرکت می کنند.
اجزایی که برهمکنش قوی تری با فاز ثابت دارند، زمان بیشتری برای شویش از ستون دارند، در حالی که برهمکنش های ضعیف تر دارند، سریع تر شستشو می شوند. اجزای شسته شده جمع آوری می شوند و غلظت آنها قابل تعیین است.
کروماتوگرافی ستونی
کروماتوگرافی را می توان با استفاده از حالت های مختلف، بسته به برهمکنش های خاص بین اجزای نمونه و فاز ساکن انجام داد.
در روش جذبی، فاز ساکن با اجزای خاصی از مخلوط نمونه میل ترکیبی دارد. این اجزا بر روی سطح فاز ساکن جذب می شوند و بنابراین، حرکت آنها به تأخیر می افتد.
اجزای با جذب قوی تر، تعامل بیشتری با فاز ثابت داشته و بنابراین، دیرتر شستشو داده می شوند، در حالی که برای اجزای با جذب ضعیف، برعکس است.
برای مثال برای یک فاز ثابت قطبی، شویش بر پایه قطبیت اجزای مخلوط است:اجزای کمتر قطبی اول شسته میشوند و به دنبال آنها اجزایی که قطبیت بیشتری دارند.
فیزیک پشت کروماتوگرافی جذبی شامل چندین عامل مرتبط با برهمکنش بین اجزای مخلوط نمونه و فاز ساکن است.
مکانیزم جذب سطحی
به فرآیندی اطلاق می شود که طی آن مولکول های مخلوط نمونه به سطح فاز ساکن می چسبند و توسط نیروهای بین مولکولی بین مولکول ها و فاز ساکن کنترل می شود.
این نیروها می توانند شامل نیروهای واندروالس، پیوند هیدروژنی، برهمکنش های دوقطبی-دوقطبی یا برهمکنش های شیمیایی خاص باشند.
فرآیندی است که طی آن مولکول های جذب شده از سطح فاز ساکن آزاد می شوند و زمانی اتفاق می‌افتد که ماده شوینده که در ستون جریان دارد، برای برهمکنش با مولکول‌های جذب شده با فاز ساکن رقابت می کند.
برهمکنش ضعیف تر بین مولکول ها و فاز ساکن، دفع آسان تر و شویش سریع تری را ممکن می سازد.
انتشار نقش مهمی در کروماتوگرافی جذب ایفا می کند زیرا حرکت مولکول ها را در فاز ساکن کنترل می کند و بر سرعتی که اجزا با فاز ثابت برهمکنش دارند و توسط آن حفظ می شوند، تأثیر می گذارد.
هنگامی که یک جزء به سطح فاز ساکن می رسد، باید از طریق منافذ و کانال های فاز ساکن پخش شود تا به محل های جذب برسد.
فرآیند جذب و دفع زمانی به حالت تعادل می رسند که سرعت جذب برابر با سرعت دفع باشد و در این حالت، توزیع اجزا بین فاز ساکن و فاز متحرک به یک شرایط پایدار می رسد.
تعادل بین حالت های جذب شده و واجذب تحت تأثیر پارامترهایی مانند دما، فشار و غلظت ماده شوینده است.
توزیع متفاوت اجزای مخلوط نمونه میان دو مایع مخلوط ناشونده، پایه جداسازی در کروماتوگرافی توزیع است و به توزیع اجزا بین فاز ساکن و فاز متحرک بر اساس حلالیت یا میل ترکیبی متفاوت آنها برای هر فاز اشاره دارد.
در این نوع از کروماتوگرافی، فاز ثابت می تواند یک پایه جامد پوشش داده شده با یک فیلم مایع یا یک فاز مایع بی حرکت بر روی پایه باشد و فاز متحرک نیز معمولاً یک مایع یا یک گاز است.
در حالت تعادل، غلظت نسبی اجزا در فاز ثابت و متحرک تثبیت می شود و اجزای با ضرایب توزیع بالاتر زمان بیشتری را در فاز ثابت می گذرانند و در نتیجه زمان ماندگاری افزایش می یابد.
دانشمندان و محققان با کنترل خواص فازهای ثابت و متحرک و تنظیم پارامترهایی مانند دما و ابعاد ستون، می توانند فرآیند توزیع را برای دستیابی به جداسازی موثر بهینه نمایند.
مکانیزم توزیع
این حالت، اجزا را بر اساس برهمکنش و تعویض یون با گروه های عاملی باردار موجود در فاز ثابت جداسازی می کند. بسته به بار فاز ثابت، اجزا ممکن است کاتیون (دارای بار مثبت) یا آنیون (دارای بار منفی) باشند.
در حقیقت، اجزای دارای بارهای مخالف با فاز ساکن، قویاً به اجزای این فاز متصل می شوند (جاذبه الکتروستاتیک) و دیرتر شستشو می شوند، در حالی که اجزای دارای بار مشابه، به دلیل دافعه سریع تر شسته می شوند.
کروماتوگرافی تبادل یون
کنترل pH، قدرت یونی و غلظت بافرهای فاز متحرک این امکان را فراهم می کنند تا جداسازی اجزای باردار را در این نوع کروماتوگرافی بهینه شود.
کروماتوگرافی میل ترکیبی از برهمکنش های مولکولی بسیار خاص بین یک جزء هدف (مانند یک پروتئین یا آنزیم) و یک لیگاند بی حرکت در فاز ساکن استفاده می کند.
جزء هدف به طور انتخابی به لیگاند متصل می شود و با کنترل ویژگی لیگاند و بهینه سازی شرایط اتصال و شویش، امکان جداسازی و خالص سازی مولکول های هدف از مخلوط را فراهم می کند.
این موضوع، با تغییر شرایط برای بر هم زدن اتصال بین هدف و لیگاند به دست می آید. استراتژی های شویش ممکن است شامل تغییر pH، قدرت یونی، یا دمای فاز متحرک، معرفی مولکول های رقیب، یا استفاده از بافرهای شستشوی خاص باشد.
این تغییرات برهمکنش بین مولکول هدف و لیگاند را ضعیف می کند و به مولکول هدف اجازه شستشو می دهد.
لیگاند به گونه ای طراحی شده است که میل ترکیبی و انتخاب پذیری بالایی برای مولکول هدف داشته باشد و به آن اجازه می دهد تا به طور انتخابی به هدف متصل شود، در حالی که سایر اجزای نمونه از ستون عبور می کنند.
این تشخیص معمولاً بر اساس شکل مکمل، توزیع بار، آبگریزی یا سایر فعل و انفعالات خاص است.
اتصال بین مولکول هدف و لیگاند برگشت پذیر است. این به این معنی است که مولکول هدف می تواند تحت شرایط خاصی (مانند pH خاص، دما یا وجود یون های خاص) محکم به لیگاند متصل شود، اما می تواند تحت شرایط مختلف نیز آزاد شود.
امکان اتصال برگشت پذیر اجازه می دهد تا مولکول هدف در فاز ثابت باقی بماند، در حالی که اجزای غیر اختصاصی شسته می شوند.
مکانیزم کروماتوگرافی میل ترکیبی
این تکنیک، به طور گسترده ای در بیوشیمی، بیوتکنولوژی و تحقیقات دارویی برای کاربردهایی مانند تصفیه پروتئین، خالص سازی آنتی بادی و کشف دارو استفاده می شود.
فیزیک کروماتوگرافی کایرال شامل جداسازی انانتیومرها (Enantiomers) است که ایزومرهای آینه ای یک مولکول هستند که دارای خواص فیزیکی و شیمیایی یکسانی با مولکول هستند اما برهمکنش های متفاوتی را با محیط های کایرال نشان می دهند.
انانتیومرها به دلیل آرایش های سه بعدی متمایزی که دارند، برهمکنش های متفاوتی با محیط های کایرال دارند. کروماتوگرافی کایرال از این تفاوت ها و یک فاز ثابت کایرال استفاده می کند که از یک رزین یا یک سطح اصلاح شده با انتخابگرهای کایرال متصل است.
انتخابگرهای کایرال می توانند مولکول های آلی کوچک یا پلیمرهایی باشند که دارای مراکز کایرال یا حفره های کایرال هستند.
هنگامی که یک نمونه حاوی مخلوطی از انانتیومرها از ستون کروماتوگرافی عبور می کند، فاز ثابت کایرال به طور متفاوتی با هر انانتیومر برهمکنش می کند که منجر به احتباس انتخابی یا نرخ های مختلف شستشو می شود.
انتخاب انانتیو تحت تأثیر عواملی مانند ماهیت انتخابگر کایرال، ترکیب حلال، دما و pH است و از برهمکنش های مختلف ناشی می شود، از جمله اثرات فضایی، پیوند هیدروژنی، نیروهای واندروالس، برهمکنش های دوقطبی-دوقطبی، و برهمکنش های π-π، که بین انانتیومرها متفاوت است.
با دستکاری این عوامل، برهمکنش های خاص بین انانتیومرها و فاز ثابت کایرال را می توان تضعیف یا مختل کرد و امکان جداسازی انانتیومرها را فراهم کرد.
این تکنیک نقش مهمی در تعیین خلوص انانتیومر ترکیبات کایرال ایفا می کند و در سنتز، تولید و کنترل کیفیت داروهای کایرال و سایر مولکول های کایرال نقش دارد.
مکانیزم کلی کروماتوگرافی نوع کایرال
این حالت که با نام کروماتوگرافی فیلتراسیون ژل نیز شناخته می شود، اجزا را بر اساس اندازه و وزن مولکولی آنها جدا می کند. در اینجا جنبه های کلیدی فیزیک درگیر در فرایند کروماتوگرافی اندازه آمده است:
این نوع روش، از یک فاز ثابت متخلخل متشکل از دانه ها یا ژل ها با توزیع اندازه منافذ کنترل شده استفاده می کند. این ذرات متخلخل، شبکه ای سه بعدی از کانال ها یا منافذ به هم پیوسته را ایجاد می کنند و اندازه منافذ تعیین می کند که کدام مولکول می تواند وارد ساختار منافذ داخلی شود یا به آن دسترسی پیدا کند.
اجزای کوچک تر می توانند وارد منافذ متخلخل شوند و شستشوی آنها بیشتر طول می کشد، در حالی که اجزای بزرگ تر منافذ را دور می زنند و سریع تر شستشو می شوند.
راندمان جداسازی و وضوح این تکنیک به ویژگی های فاز ثابت، مانند اندازه ذرات، توزیع اندازه منافذ، و ویژگی های پلیمر در صورت استفاده از شبکه ای مبتنی بر ژل بستگی دارد. توزیع اندازه منافذ باریک و اندازه ذرات یکنواخت منجر به وضوح بهتر و راندمان جداسازی بالاتری می شود.
برای تعیین وزن مولکولی یا اندازه مولکول های ناشناخته، یک منحنی کالیبراسیون ساخته می شود. استانداردهای کالیبراسیون وزن‌های مولکولی شناخته‌شده از طریق ستون اجرا می شوند و زمان نگهداشت آنها برحسب وزن مولکولی ترسیم می شود.
در نهایت، وزن مولکولی نمونه ناشناخته را می توان با مقایسه زمان ماند آن با منحنی کالیبراسیون تخمین زد.
مکانیزم کلی کروماتوگرافی اندازه
در این مقاله، مکانیزم های مختلف تکنیک کروماتوگرافی را مورد ارزیابی قرار دادیم و فیزیک آنها را بیان کردیم. در ادامه، به کاربردهای آنها نیز خواهیم پرداخت. امیدواریم که مفید باشد.
مقالات منتشر شده در ساعاتی قبل